DPSPDNT - Teses de doutoramento
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Percorrer DPSPDNT - Teses de doutoramento por orientador "Farinha, Carlos"
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- Base genética da hipercolesterolemia familiarPublication . dos Santos Alves, Ana Catarina; Bourbon, Mafalda; Farinha, Carlos[PT] A Hipercolesterolemia Familiar (FH) é uma doença autossómica dominante caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol LDL no plasma, conduzindo à sua acumulação principalmente nos tendões (xantomas tendinosos) e nas artérias. Devido à acumulação de lípidos nas artérias, estes indivíduos desenvolvem aterosclerose muito cedo, tendo eventos cardiovasculares prematuramente. A FH apresenta uma frequência de 1/500, na forma heterozigótica, na maioria das populações europeias. Em Portugal estima-se que existam cerca de 20 000 casos de FH. A identificação clínica da FH é possível, mas apenas o diagnóstico molecular da FH permite a correta identificação da doença, fundamentando a instituição de terapêutica farmacológica mais agressiva e/ou precoce, com a consequente redução do risco cardiovascular nos indivíduos afetados. Geneticamente esta patologia caracteriza-se por mutações em três genes: LDLR, APOB e PCSK9. No entanto, a percentagem de indivíduos identificados molecularmente situa-se entre 30-80% dependendo da população estudada, uma vez que em Portugal apenas 40% dos doentes com diagnóstico clínico de FH apresentam uma mutação causadora de doença num dos três genes associados à FH. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF) tem como objetivos a realização de um estudo epidemiológico para a determinação da prevalência e distribuição da FH em Portugal, tendo implementado o estudo molecular desta doença. Para tal, a caracterização funcional de alterações encontradas em genes associados à FH é de extrema importância pois permite obter um diagnóstico definitivo de FH. O objetivo deste trabalho doutoral era identificar e caracterizar a causa genética da hipercolesterolemia em famílias sem mutação identificável nos genes LDLR e APOB pelas metodologias usualmente utilizadas. A primeira parte do presente foi dedicada à reorganização do diagnóstico molecular da FH e à pesquisa de mutações num novo gene – PCSK9 –, à pesquisa de grandes rearranjos através da técnica de MLPA, bem como ao estudo dos genes APOB e LDLRAP1 através de duas abordagens diferentes da técnica de pirosequenciação. No total foram estudados no EPHF 642 casos índex (CI) (250 crianças e 392 adultos), tendo sido identificada uma alteração em 294 indivíduos. A reorganização do EPHF permitiu identificar 6 grandes rearranjos através da técnica de MLPA, identificando deste modo mais 19 indivíduos e 4 alterações no gene PCSK9 em 5 CI. Através da técnica de pirosequenciação, identificaram-se 10 novas alterações potencialmente patogénicas no gene APOB em 10 indivíduos e 4 alterações no gene LDLRAP1 em 4 CI. A segunda parte do trabalho incluído nesta tese centrou-se na análise funcional de alterações cuja patogenicidade era desconhecida, uma vez que dos 294 CI com uma alteração apenas 192 CI apresentam uma mutação comprovadamente patogénica. Desta forma, foram analisadas funcionalmente para o gene LDLR 11 alterações de splicing, uma alteração no promotor e 4 alterações pontuais. Verificou-se que 8 alterações de splicing e 3 alterações missense eram patogénicas, e que 3 alterações de splicing e 1 alteração missense não originavam doença. No gene APOB foram estudadas funcionalmente 4 alterações, das quais apenas 2 destas são patogénicas. Estas mutações foram as primeiras descritas fora da região consensus de ligação do ligando ao LDLR postulada anteriormente. Na impossibilidade da caracterização funcional de todas as alterações cujo estudo não tinha sido realizado, foi desenvolvida uma classificação com base em 6 programas bioinformáticos para as alterações missense e 3 programas para as alterações de splicing. Com base nesta classificação, identificaram-se 435 CI (175 CI e 260 familiares) com diagnóstico definitivo de FH, e 196 indivíduos (116 CI e 80 familiares) apresentavam um diagnóstico provável, 79 um diagnóstico possível e 46 neutro. Verificou-se que 594 indivíduos apresentavam uma alteração no gene LDLR, 30 indivíduos têm uma alteração no gene APOB e 7 indivíduos no gene PCSK9. A terceira parte deste trabalho doutoral teve como objetivo correlacionar o genótipo vs com o fenótipo de todos os CI referenciados ao EPHF, tendo por base os diferentes diagnósticos moleculares que foram obtidos através da classificação das alterações com e sem estudos funcionais. A comparação dos fenótipos apresentados por crianças e adultos com diferentes tipos de mutação revelou que, embora em idade pediátrica o fenótipo não dependa do tipo de mutação, na idade adulta já existe uma clara diferença de fenótipos entre portadores de mutações nulas e missense. Esta observação reforça a importância do diagnóstico molecular precoce de modo a estratificar o risco cardiovascular no grupo pediátrico, uma vez que as crianças com mutações nulas apresentam um maior risco cardiovascular, necessitando por isso de um aconselhamento especializado e implementação ainda mais precoce de terapêuticas hipolipemiantes. A última parte deste trabalho focou-se na realização do estudo de sequenciação de exoma a 5 CI com diagnóstico clínico de FH, mas sem uma mutação identificada num dos 3 genes associados à FH. Uma vez que a sequenciação de exoma origina uma quantidade elevada de dados por amostra, de modo a restringir a análise, foi realizada uma seleção de 49 genes associados ao metabolismo lipídico, tendo-se verificado a existência de 20 alterações distribuídas por 17 genes. Através deste estudo, identificaram-se 2 alterações no gene FLT1 em 2 CI não relacionados e 1 alteração no gene SORT1 noutro CI que cossegregam com a hipercolesterolemia na família. Os estudos funcionais das alterações encontradas nestes genes serão importantes para classificar as mesmas quanto à sua patogenicidade. No caso de se comprovar que alguma destas alterações é funcional, esta será a primeira evidência de um quarto gene associado a FH. Uma vez que a FH se encontra sub-diagnosticada em Portugal, o diagnóstico e aconselhamento genético da FH são importantes para a correta perceção e prevenção do risco familiar de DCV. Nas crianças e adolescentes, o diagnóstico genético é ainda mais importante, uma vez que se sabe que o risco cardiovascular é elevado, mas evitável, se medidas preventivas forem colocadas em prática. O futuro passa pela prevenção, em vez da resolução tardia das complicações cardiovasculares inerentes a esta patologia.