Departamento de Genética Humana
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Browsing Departamento de Genética Humana by advisor "Alves, Sandra"
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- Caracterização genotípica de doentes portugueses com patologias associadas ao complexo multienzimático lisossomal: sialidose e galactosialidosePublication . Coutinho, Maria Francisca; Alves, Sandra; Prata, Maria JoãoIntrodução: Na célula, a actividade funcional das enzimas lisossomais sialidase, beta-galactosidase e N-acetilaminogalacto-6-sulfatase, depende da sua associação com a catepsina A para formar o complexo multienzimático lisossomal. Mutações genéticas em qualquer um dos componentes deste complexo levam a uma deficiência funcional que pode estar na base do aparecimento de uma doença de sobrecarga lisossomal. Neste trabalho estudaram-se os defeitos moleculares causais das doenças sialidose (mutações no gene que codifica a sialidase, NEU1) e galactosialidose (mutações no gene que codifica a catepsina A, PPGB) na população portuguesa. Métodos: A amostra analisada incluiu sete doentes portugueses, três com sialidose e quatro com galactosialidose cujo diagnóstico clínico tinha sido bioquimicamente confirmado. Utilizando DNA genómico, extraído de fibroblastos dos doentes, efectuou-se o estudo molecular dos genes PPGB e NEU1. Em alguns doentes foi também efectuada uma análise ao cDNA. Em todos os doentes analisados os níveis de mRNA foram determinadas por qtRT-PCR a tempo real. O impacto das novas mutações missense foi avaliado ao nível da função e da estrutura tridimensional de cada uma das proteínas através de programas bioinformáticos apropriados (Polyphen, SIFT, PyMOL e Swiss-pdbViewer). Resultados: No gene NEU1, foram identificadas quatro novas mutações, três delas missense (p.P153L, p.D187N, p.Q235H) e uma nonsense (p.R341X). Nos três doentes com galactosialidose, foram detectados quatro alelos diferentes no gene PPGB: duas mutações missense, uma nova (p.G57V) e uma já descrita (p.V104M) e duas novas delecções (c.228-229delC e c.991-992delT). Os estudos de expressão dos genes PPGB e NEU1 por qRT-PCR mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA na presença de algumas mutações (mRNA PPGB: p.G57V e c.991-992delT; mRNA NEU1: p.Q235H). No que se refere às novas mutações, as previsões do potencial deletério apresentadas pelos softwares Polyphen e SIFT foram unânimes a indicar um carácter patogénico para cada uma delas. De igual modo, quando as consequências das mesmas alterações foram avaliadas através de estudos tridimensionais, obtiveram-se dados que vieram confirmar e reforçar as previsões dos meios bioinformáticos, sobre o seu carácter deletério. Essas previsões foram, então, confrontadas com o fenótipo clínico de todos os doentes a que tivemos acesso. Foi possível, mais uma vez confirmar todas as previsões, estabelecendo uma correlação genótipo-fenótipo bastante coesa, uma vez que, as mutações que se previam mais deletérias, foram detectadas nos doentes com as formas mais graves de cada uma das patologias. Conclusões: Neste estudo foram caracterizados três casos de sialidose e quatro casos de galactosialidose. Como resultado, identificaram-se oito mutações diferentes. Dessas mutações, 7 foram descritas pela primeira vez: P153L, D187N e Q235H no gene NEU1 e G57V, V104M, c.228-229delC e c.991.992delT no gene PPGB. Foram efectuados estudos tridimensionais para todas as novas mutações e os resultados obtidos vieram confirmar e reforçar as previsões que já haviam sido obtidas utilizando os softwares Polyphen e SIFT, sobre o potencial efeito de cada uma delas. Finalmente, as estratégias desenvolvidas para análise mutacional são importantes ferramentas que permitirão a detecção de portadores e o diagnóstico molecular pré-natal, levando a uma melhoria do aconselhamento genético, o que traz grandes benefícios para as famílias afectadas. Estes conhecimentos são ainda importantes para uma melhor compreensão da genética do complexo multienzimático lisossomal.