Departamento de Genética Humana
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Percorrer Departamento de Genética Humana por orientador "Alves, Sandra"
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- Caracterização genotípica de doentes portugueses com patologias associadas ao complexo multienzimático lisossomal: sialidose e galactosialidosePublication . Coutinho, Maria Francisca; Alves, Sandra; Prata, Maria JoãoIntrodução: Na célula, a actividade funcional das enzimas lisossomais sialidase, beta-galactosidase e N-acetilaminogalacto-6-sulfatase, depende da sua associação com a catepsina A para formar o complexo multienzimático lisossomal. Mutações genéticas em qualquer um dos componentes deste complexo levam a uma deficiência funcional que pode estar na base do aparecimento de uma doença de sobrecarga lisossomal. Neste trabalho estudaram-se os defeitos moleculares causais das doenças sialidose (mutações no gene que codifica a sialidase, NEU1) e galactosialidose (mutações no gene que codifica a catepsina A, PPGB) na população portuguesa. Métodos: A amostra analisada incluiu sete doentes portugueses, três com sialidose e quatro com galactosialidose cujo diagnóstico clínico tinha sido bioquimicamente confirmado. Utilizando DNA genómico, extraído de fibroblastos dos doentes, efectuou-se o estudo molecular dos genes PPGB e NEU1. Em alguns doentes foi também efectuada uma análise ao cDNA. Em todos os doentes analisados os níveis de mRNA foram determinadas por qtRT-PCR a tempo real. O impacto das novas mutações missense foi avaliado ao nível da função e da estrutura tridimensional de cada uma das proteínas através de programas bioinformáticos apropriados (Polyphen, SIFT, PyMOL e Swiss-pdbViewer). Resultados: No gene NEU1, foram identificadas quatro novas mutações, três delas missense (p.P153L, p.D187N, p.Q235H) e uma nonsense (p.R341X). Nos três doentes com galactosialidose, foram detectados quatro alelos diferentes no gene PPGB: duas mutações missense, uma nova (p.G57V) e uma já descrita (p.V104M) e duas novas delecções (c.228-229delC e c.991-992delT). Os estudos de expressão dos genes PPGB e NEU1 por qRT-PCR mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA na presença de algumas mutações (mRNA PPGB: p.G57V e c.991-992delT; mRNA NEU1: p.Q235H). No que se refere às novas mutações, as previsões do potencial deletério apresentadas pelos softwares Polyphen e SIFT foram unânimes a indicar um carácter patogénico para cada uma delas. De igual modo, quando as consequências das mesmas alterações foram avaliadas através de estudos tridimensionais, obtiveram-se dados que vieram confirmar e reforçar as previsões dos meios bioinformáticos, sobre o seu carácter deletério. Essas previsões foram, então, confrontadas com o fenótipo clínico de todos os doentes a que tivemos acesso. Foi possível, mais uma vez confirmar todas as previsões, estabelecendo uma correlação genótipo-fenótipo bastante coesa, uma vez que, as mutações que se previam mais deletérias, foram detectadas nos doentes com as formas mais graves de cada uma das patologias. Conclusões: Neste estudo foram caracterizados três casos de sialidose e quatro casos de galactosialidose. Como resultado, identificaram-se oito mutações diferentes. Dessas mutações, 7 foram descritas pela primeira vez: P153L, D187N e Q235H no gene NEU1 e G57V, V104M, c.228-229delC e c.991.992delT no gene PPGB. Foram efectuados estudos tridimensionais para todas as novas mutações e os resultados obtidos vieram confirmar e reforçar as previsões que já haviam sido obtidas utilizando os softwares Polyphen e SIFT, sobre o potencial efeito de cada uma delas. Finalmente, as estratégias desenvolvidas para análise mutacional são importantes ferramentas que permitirão a detecção de portadores e o diagnóstico molecular pré-natal, levando a uma melhoria do aconselhamento genético, o que traz grandes benefícios para as famílias afectadas. Estes conhecimentos são ainda importantes para uma melhor compreensão da genética do complexo multienzimático lisossomal.
- Development of Cellular and Animal Models for Mucopolysaccharidosis Type IIIPublication . Gonçalves, Francisca; Alves, Sandra; Coutinho, Maria FranciscaA mucopolissacaridose tipo III (MPS IIIA, B, C e D), ou Síndrome de Sanfilippo, é um subgrupo de doenças lisossomais de sobrecarga (DLS). São doenças raras, monogénicas e neurodegenerativas causadas por mutações nos genes que codificam as enzimas responsáveis pela degradação intralisossomal do sulfato de heparano (HS). Os doentes apresentam um fenótipo clínico grave, caracterizado por demência infantil de início precoce e por morte prematura. Embora tenham sido alcançados progressos significativos no seu conhecimento e algumas novas terapias tenham avançado até à fase de ensaios clínicos, ainda existem muitos aspetos dos mecanismos patofisiológicos inerentes a esta síndrome por desvendar, não estando atualmente disponível um tratamento eficaz. Modelos celulares e animais que reproduzam o fenótipo da doença, constituem recursos de grande valor, possibilitando estudos mais aprofundados e incisivos e, a identificação de novos alvos terapêuticos, além de uma triagem mais eficiente de novos fármacos. Neste trabalho procurámos responder a essa necessidade através de: (i) uma caracterização aprofundada de duas linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs, do inglês: induced pluripotent stem cells), obtidas por reprogramação de fibroblastos de doentes MPS IIIC e IIID, previamente desenvolvidas no nosso grupo; e (ii) do estabelecimento de duas novas linhas de células estaminais de dentes decíduos esfoliados (SHEDs, do inglês: stem cells from human exfoliated deciduous teeth) derivadas de doentes com MPS IIIB e IIIC. Paralelamente, desenvolvemos um novo modelo animal para MPS IIIB, através da geração de um mutante nulo funcional na geração F0 de peixe-zebra (Danio rerio) através da tecnologia de CRISPR-Cas9.