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Search for new modulators of Phe508del-CFTR retention at the plasma membrane
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Abstract(s)
Cystic fibrosis (CF) is a complex inherited disorder caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. Around 2000 disease causing mutations are known for this gene, which encodes a Chloride (Cl−) channel expressed at the plasma membrane (PM) of epithelial cells. The most frequent CFTR mutation, the deletion of phenylalanine 508 (Phe508del), causes the protein to misfold and be prematurely degraded. Low temperature or pharmacological “correctors” can partly rescue Phe508del-CFTR processing defect and enhance the channel traffic to the cell surface. Nevertheless, the rescued channels show partial channel function and a highly decreased PM half-life, due to accelerated endocytosis and fast turnover. Given this accelerated endocytic rate, new strategies aiming to retain rescued Phe508del-CFTR at the cell surface could be relevant as to enhance the efficacy of currently available pharmacological correctors. For that reason, the major objective of this dissertation is to identify novel cellular pathways or key interactors for the modulation of CFTR surface retention. Previous results from the host laboratory had showed that stimulation of endogenous RAC1 by Hepatocyte Growth Factor (HGF) signaling potentiated the retention of rescued Phe508del-CFTR at the PM by promoting an interaction between the actin-binding adaptor ezrin (EZR) and the Na+/H+ exchange regulatory factor-1 (NHERF1), enhancing CFTR anchoring to the actin cytoskeleton. In chapter 2 we showed that the mechanism behind this stabilization lies on a conformational change in NHERF1, triggered by EZR activation upon RAC1 signaling, which is then able to bind and stabilize misfolded CFTR at the PM. However, HGF/RAC1 signaling pathway is known to have proliferative and pleiotropic biological functions, which limit its application for therapeutic intervention. Therefore, in chapter 3, we investigated the effect of HGF treatment in epithelium-like cellular models, in combination with the most common administrated drugs. Contrary to what would be commonly assumed, we found that prolonged co-administration of HGF actually prevented previously unrecognized epithelial dedifferentiation effects of prolonged exposure to the FDA-approved Phe508del-CFTR corrector VX-809. It also significantly increased the Phe508del-CFTR functional rescue by the FDA- and EMA-approved VX-809/VX-770 drug combination, preventing the destabilization of the PM rescued channels by prolonged exposure to the VX-770 potentiator drug. These results suggest that HGF co-administration could indeed be beneficial for CF patients and should be further clinically explored. Lastly, since we showed that the type of protein interactions that wt- and rescued Phe508del-CFTR establish at the cell surface can be major determinants of their different PM stabilities, in chapter 4 we identified, for the first time, the core components of the macromolecular complexes assembled around wt- and rescued Phe508del-CFTR proteins at the PM. By identifying exclusive PM interactions between rescued Phe508del-CFTR, NHERF1 and EZR, we were able to recognize Calpain 1 as a key contributor for the decreased surface stability of pharmacologically rescued Phe508del-CFTR, probably acting through the disruption of the EZR-actin cytoskeleton binding.
A Fibrose Quística (FQ) é uma doença hereditária, letal, cujo nome deriva do aspeto quístico e fibroso do pâncreas dos portadores da doença. É uma das doenças genéticas mais comuns, afetando aproximadamente 70.000 pessoas em todo o mundo, com maior expressão na população caucasiana. Em Portugal estima-se que nasçam cerca de 30 a 40 crianças com FQ por ano. A doença é causada por alterações que ocorrem num único gene – o gene CFTR (do inglês, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Este gene codifica um canal de cloreto (Cl- ), expresso maioritariamente na membrana apical das células epiteliais. As mutações neste canal levam a uma secreção deficiente de Cl- no epitélio, causando um desequilíbrio eletrolítico que provoca várias manifestações sistémicas. Os sistemas mais afetados são o pulmonar e gastrointestinal, onde muco extremamente viscoso é acumulado, causando infeções e inflamações pulmonares crónicas e obstrução pancreática com consequente malnutrição. A principal causa de morte por FQ é a falência pulmonar, sendo a esperança média de vida atual entre os 35 e os 40 anos de idade. À data existem mais de 2000 mutações descritas para o gene CFTR. A mutação mais frequente é uma deleção de um resíduo de fenilalanina na posição 508, chamada Phe508del, estando presente em 85% dos doentes em pelo menos num alelo. Em Portugal os números indicam que esta está presente em cerca de 85% dos doentes com FQ. Esta mutação provoca, em primeira instância, defeitos no processamento (folding) da CFTR, impedindo que esta atinja a membrana plasmática (MP). Adicionalmente, as poucas moléculas CFTR-Phe508del que conseguem chegar à superfície das células apresentam defeitos de função, ao nível da abertura do canal, bem como um tempo de semivida na membrana (estabilidade na MP) bastante reduzido, quando comparado com a CFTR normal. Atualmente existem compostos capazes de promover o resgate parcial do folding da CFTR-Phe508del e o seu tráfego para a MP (denominados “corretores”, como o VX-809) e a abertura do canal na MP (denominados “potenciadores”, como o VX-770). No entanto, não existe de momento qualquer composto que aumente o tempo de semi-vida e a estabilidade do canal na MP. Nesse sentido, o principal objetivo desta dissertação é identificar novos modeladores ou vias celulares que aumentem a retenção na MP da CFTR-Phe508del resgatada farmacologicamente. É sabido que o canal CFTR está associado a várias outras proteínas, formando um grande complexo proteico à superfície das células. Estas interações entre proteínas são determinantes para a função e regulação do canal na MP. De acordo com este conhecimento, o laboratório de acolhimento mostrou, anteriormente, que a ativação da via RAC1 regula a ancoragem da CFTRPhe508del à MP e ao citoesqueleto de actina mediante a sua interação com duas proteínas adaptadoras, a ezrina (EZR) e o NHERF1 (do inglês Na/H exchanger regulatory factor 1). Este aumento da ancoragem ao citoesqueleto de actina deriva da ativação da proteína EZR, que após estimulada pelo RAC1 adquire uma conformação aberta e ativa, o que promove uma maior afinidade tanto para a ligação à actina como para a ligação ao complexo NHERF1-CFTR, prevenindo a endocitose do canal CFTR mutante. Usando o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), um conhecido ativador do RAC1 endógeno, foi possível observar um aumento de estabilidade três vezes maior na retenção da CFTRPhe508del resgatada farmacologicamente em células epiteliais tratadas com HGF, em comparação com células não tratadas com o fator. Assim sendo, no capítulo 2 desta dissertação, foi aprofundada a interação entre as proteínas CFTR-Phe508del, EZR e NHERF1, com o objetivo de compreender o mecanismo molecular que leva ao aumento da estabilidade do canal após a ativação da via HGF/RAC1. Demonstrámos que a ligação da EZR ativa à proteína NHERF1 promove uma mudança de conformação na mesma, levando a uma mudança de ligação da CFTR do domínio NHERF1-PDZ1 para o NHERF1-PDZ2. Esta mudança na estrutura do complexo proteico CFTR-NHERF1, induzida pelo RAC1, antecipa e previne a deteção pelos mecanismos de controlo periférico de proteínas anómalas (PPQC, do inglês Peripheral Protein Quality Control), levando a uma menor taxa de endocitose e, consequentemente, a um aumento da estabilidade da CFTR-Phe508del resgatada. Contudo, embora tenhamos mostrado e caracterizado que a via HGF/RAC1 promove a estabilidade da CFTR mutada à superfície das células, devido à descrita pleiotropia funcional do HGF e a sua associação ao desenvolvimento de certas neoplasias, a aplicabilidade deste fator em terapias é limitada. Assim sendo, no capítulo 3 desta dissertação procedeu-se ao estudo do efeito do tratamento, tanto agudo como prolongado, do HGF em modelos celulares de epitélio polarizado, em combinação com o tratamento com VX-809 e/ou VX-770. Tanto o tratamento de HGF agudo como o prolongado aumentaram os níveis de CFTR-Phe508del funcional à superfície das células, quando combinado com os fármacos VX-809 e VX-770, aprovados para a tratamento de doentes com a mutação Phe508del pelas entidades reguladoras FDA e EMA. Curiosamente, tendo já sido descrita uma destabilização por parte do potenciador VX-770 na CFTR-Phe508del resgatada por VX-809, o triplo co-tratamento com HGF teve um efeito protetor na estabilidade da CFTR-Phe508del. Mais importante, ao invés de promover a desdiferenciação e proliferação das células epiteliais polarizadas, o tratamento prolongado com HGF teve o efeito contrário, prevenindo o aumento dos marcadores Ki-67 e CK8 que, surpreendentemente, aumentaram com a exposição prolongada de VX-809 e VX770. Em conjunto, estes resultados sugerem que a co-administração de HFG com fármacos corretores e potenciadores poderá ser benéfica para pacientes com FQ. Tendo-se anteriormente demonstrado que as interações entre a CFTR e as proteínas que compõem o seu complexo macromolecular à superfície das células são importantes para a estabilidade do canal, no capítulo 4 propusemos estudar em detalhe os seus componentes, com o objetivo de identificar novos modeladores da retenção da CFTR na MP. Para isso, isolámos e identificámos as proteínas que compõem os complexos macromoleculares associados à CFTR em CFTR-wt e em CFTR-Phe508del resgatada pela baixa temperatura ou o fármaco VX-809, usando ferramentas bioinformáticas para identificar diferenças entre os mesmos. Tendo como base as interações exclusivas entre as proteínas EZR, NHERF1 e a CFTR-Phe508del resgatada identificámos a protease Calpain 1 como um modelador da estabilidade do canal na membrana. Ao diminuirmos a quantidade e função desta proteína observámos um aumento substancial na abundância, função e retenção na MP da CFTR-Phe508del resgatada. Sabendo que a EZR é um substrato conhecido da protease Calpain 1 (Calcium-Activated Neutral Proteinase 1), mostrámos que, à superfície das células, a EZR aumenta quando diminuímos a quantidade de Calpain 1 disponível, não sendo observadas quaisquer diferenças na quantidade de NHERF1. Assim sendo, propusemos que a Calpain 1 é um regulador negativo da estabilidade da CFTR-Phe508del na MP, atuando através da proteólise da proteína EZR, destabilizando o seu complexo macromolecular. Como a Calpain 1 foi identificada como sendo uma proteína exequível de ser farmacologicamente modelada pela base de dados chEMBL, o seu estudo pode vir a ser importante para o desenvolvimento de novas terapias que promovam a estabilidade na MP da CFTR. Em resumo, esta dissertação cumpriu os objetivos propostos, dado que identificou e caracterizou vários modeladores da retenção da CFTR-Phe508del resgatada farmacologicamente para a superfície das células. Estes resultados abrem portas para o estudo e desenvolvimento de novas terapias combinadas, pois, como anteriormente referido, neste momento não existe qualquer composto disponível que aumente o tempo de semi-vida e a estabilidade do canal na MP. Algumas das implicações deste estudo não são exclusivas apenas para a mutação Phe508del, podendo também ser aplicados a outras mutações que diminuam a estabilidade da proteína CFTR, como a mutação c.120del23 e Q1412x.
A Fibrose Quística (FQ) é uma doença hereditária, letal, cujo nome deriva do aspeto quístico e fibroso do pâncreas dos portadores da doença. É uma das doenças genéticas mais comuns, afetando aproximadamente 70.000 pessoas em todo o mundo, com maior expressão na população caucasiana. Em Portugal estima-se que nasçam cerca de 30 a 40 crianças com FQ por ano. A doença é causada por alterações que ocorrem num único gene – o gene CFTR (do inglês, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Este gene codifica um canal de cloreto (Cl- ), expresso maioritariamente na membrana apical das células epiteliais. As mutações neste canal levam a uma secreção deficiente de Cl- no epitélio, causando um desequilíbrio eletrolítico que provoca várias manifestações sistémicas. Os sistemas mais afetados são o pulmonar e gastrointestinal, onde muco extremamente viscoso é acumulado, causando infeções e inflamações pulmonares crónicas e obstrução pancreática com consequente malnutrição. A principal causa de morte por FQ é a falência pulmonar, sendo a esperança média de vida atual entre os 35 e os 40 anos de idade. À data existem mais de 2000 mutações descritas para o gene CFTR. A mutação mais frequente é uma deleção de um resíduo de fenilalanina na posição 508, chamada Phe508del, estando presente em 85% dos doentes em pelo menos num alelo. Em Portugal os números indicam que esta está presente em cerca de 85% dos doentes com FQ. Esta mutação provoca, em primeira instância, defeitos no processamento (folding) da CFTR, impedindo que esta atinja a membrana plasmática (MP). Adicionalmente, as poucas moléculas CFTR-Phe508del que conseguem chegar à superfície das células apresentam defeitos de função, ao nível da abertura do canal, bem como um tempo de semivida na membrana (estabilidade na MP) bastante reduzido, quando comparado com a CFTR normal. Atualmente existem compostos capazes de promover o resgate parcial do folding da CFTR-Phe508del e o seu tráfego para a MP (denominados “corretores”, como o VX-809) e a abertura do canal na MP (denominados “potenciadores”, como o VX-770). No entanto, não existe de momento qualquer composto que aumente o tempo de semi-vida e a estabilidade do canal na MP. Nesse sentido, o principal objetivo desta dissertação é identificar novos modeladores ou vias celulares que aumentem a retenção na MP da CFTR-Phe508del resgatada farmacologicamente. É sabido que o canal CFTR está associado a várias outras proteínas, formando um grande complexo proteico à superfície das células. Estas interações entre proteínas são determinantes para a função e regulação do canal na MP. De acordo com este conhecimento, o laboratório de acolhimento mostrou, anteriormente, que a ativação da via RAC1 regula a ancoragem da CFTRPhe508del à MP e ao citoesqueleto de actina mediante a sua interação com duas proteínas adaptadoras, a ezrina (EZR) e o NHERF1 (do inglês Na/H exchanger regulatory factor 1). Este aumento da ancoragem ao citoesqueleto de actina deriva da ativação da proteína EZR, que após estimulada pelo RAC1 adquire uma conformação aberta e ativa, o que promove uma maior afinidade tanto para a ligação à actina como para a ligação ao complexo NHERF1-CFTR, prevenindo a endocitose do canal CFTR mutante. Usando o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), um conhecido ativador do RAC1 endógeno, foi possível observar um aumento de estabilidade três vezes maior na retenção da CFTRPhe508del resgatada farmacologicamente em células epiteliais tratadas com HGF, em comparação com células não tratadas com o fator. Assim sendo, no capítulo 2 desta dissertação, foi aprofundada a interação entre as proteínas CFTR-Phe508del, EZR e NHERF1, com o objetivo de compreender o mecanismo molecular que leva ao aumento da estabilidade do canal após a ativação da via HGF/RAC1. Demonstrámos que a ligação da EZR ativa à proteína NHERF1 promove uma mudança de conformação na mesma, levando a uma mudança de ligação da CFTR do domínio NHERF1-PDZ1 para o NHERF1-PDZ2. Esta mudança na estrutura do complexo proteico CFTR-NHERF1, induzida pelo RAC1, antecipa e previne a deteção pelos mecanismos de controlo periférico de proteínas anómalas (PPQC, do inglês Peripheral Protein Quality Control), levando a uma menor taxa de endocitose e, consequentemente, a um aumento da estabilidade da CFTR-Phe508del resgatada. Contudo, embora tenhamos mostrado e caracterizado que a via HGF/RAC1 promove a estabilidade da CFTR mutada à superfície das células, devido à descrita pleiotropia funcional do HGF e a sua associação ao desenvolvimento de certas neoplasias, a aplicabilidade deste fator em terapias é limitada. Assim sendo, no capítulo 3 desta dissertação procedeu-se ao estudo do efeito do tratamento, tanto agudo como prolongado, do HGF em modelos celulares de epitélio polarizado, em combinação com o tratamento com VX-809 e/ou VX-770. Tanto o tratamento de HGF agudo como o prolongado aumentaram os níveis de CFTR-Phe508del funcional à superfície das células, quando combinado com os fármacos VX-809 e VX-770, aprovados para a tratamento de doentes com a mutação Phe508del pelas entidades reguladoras FDA e EMA. Curiosamente, tendo já sido descrita uma destabilização por parte do potenciador VX-770 na CFTR-Phe508del resgatada por VX-809, o triplo co-tratamento com HGF teve um efeito protetor na estabilidade da CFTR-Phe508del. Mais importante, ao invés de promover a desdiferenciação e proliferação das células epiteliais polarizadas, o tratamento prolongado com HGF teve o efeito contrário, prevenindo o aumento dos marcadores Ki-67 e CK8 que, surpreendentemente, aumentaram com a exposição prolongada de VX-809 e VX770. Em conjunto, estes resultados sugerem que a co-administração de HFG com fármacos corretores e potenciadores poderá ser benéfica para pacientes com FQ. Tendo-se anteriormente demonstrado que as interações entre a CFTR e as proteínas que compõem o seu complexo macromolecular à superfície das células são importantes para a estabilidade do canal, no capítulo 4 propusemos estudar em detalhe os seus componentes, com o objetivo de identificar novos modeladores da retenção da CFTR na MP. Para isso, isolámos e identificámos as proteínas que compõem os complexos macromoleculares associados à CFTR em CFTR-wt e em CFTR-Phe508del resgatada pela baixa temperatura ou o fármaco VX-809, usando ferramentas bioinformáticas para identificar diferenças entre os mesmos. Tendo como base as interações exclusivas entre as proteínas EZR, NHERF1 e a CFTR-Phe508del resgatada identificámos a protease Calpain 1 como um modelador da estabilidade do canal na membrana. Ao diminuirmos a quantidade e função desta proteína observámos um aumento substancial na abundância, função e retenção na MP da CFTR-Phe508del resgatada. Sabendo que a EZR é um substrato conhecido da protease Calpain 1 (Calcium-Activated Neutral Proteinase 1), mostrámos que, à superfície das células, a EZR aumenta quando diminuímos a quantidade de Calpain 1 disponível, não sendo observadas quaisquer diferenças na quantidade de NHERF1. Assim sendo, propusemos que a Calpain 1 é um regulador negativo da estabilidade da CFTR-Phe508del na MP, atuando através da proteólise da proteína EZR, destabilizando o seu complexo macromolecular. Como a Calpain 1 foi identificada como sendo uma proteína exequível de ser farmacologicamente modelada pela base de dados chEMBL, o seu estudo pode vir a ser importante para o desenvolvimento de novas terapias que promovam a estabilidade na MP da CFTR. Em resumo, esta dissertação cumpriu os objetivos propostos, dado que identificou e caracterizou vários modeladores da retenção da CFTR-Phe508del resgatada farmacologicamente para a superfície das células. Estes resultados abrem portas para o estudo e desenvolvimento de novas terapias combinadas, pois, como anteriormente referido, neste momento não existe qualquer composto disponível que aumente o tempo de semi-vida e a estabilidade do canal na MP. Algumas das implicações deste estudo não são exclusivas apenas para a mutação Phe508del, podendo também ser aplicados a outras mutações que diminuam a estabilidade da proteína CFTR, como a mutação c.120del23 e Q1412x.
Description
Tese de doutoramento, Biologia (Biologia de Sistemas), apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018
Keywords
Cystic Fibrosis CFTR Phe508del Plasma Membrane Stabilizers CFTR Interactome Fibrose Quística Estabilizadores da Membrana Plasmática Interactoma da CFTR Vias de Transdução de Sinal e Patologias Associadas