Loading...
Publication
Regulation of glucose uptake in mammalian cells by protein phosphorylation networks
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 4.16 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Glucose uptake is a key mechanism to maintain cell, tissue and body homeostasis. Among others, glucose transporter proteins (GLUTs) are responsible for glucose transport into the cell. Besides their expression level, the GLUT number present at the plasma membrane (PM) is regulated by signaling mechanisms. Previously, protein kinase WNK1 was found to phosphorylate TBC1D4, a Rab-GAP involved in membrane traffic regulation, and to regulate the surface expression of the constitutive glucose transporter GLUT1. In this work the phosphorylation of either TBC1D4 or its paralogue TBC1D1 was studied as a key step in regulatory cascades modulating glucose uptake. First, we showed that downregulation of WNK1 through RNA interference translates in a 2-fold decrease in PM GLUT1 expression and a 60% decrease in glucose uptake. Then, we compared by mass spectrometry (MS) the in vitro phosphorylation of TBC1D1 and 4 by AKT1, WNK1 and SGK1 and 3. We identified two novel WNK1-specific phosphorylation sites at TBC1D1-Ser565 and TBC1D4-Ser704 and showed that transfection of their phosphomimetic or unphosphorylatable mutants affected cell surface abundance of GLUT1. To define new biological pathways regulated by WNK1, we determined the interactome of WNK1 by MS. Interestingly, the bioinformatic and gene ontology analysis pointed to a previously unrecognized function related to mRNA processing. Our studies identified a novel function of WNK1 in alternative splicing using RAC1B in colorectal HT29 cells as a model. In particular, WNK1 acts as a scaffolding protein through complex formation with GSK3β. This complex protects GSK3β from an inhibitory phosphorylation at Ser9. The active GSK3β allows the translocation of kinase SRPK1 and splicing factor SRSF1 to the nucleus, which is important for RAC1B generation. Considering that RAC1B is known to be essential for cell survival and malignant progression, the results establish a new link between WNK kinases and tumorigenesis. Altogether, this work reinforced a role for WNK1 in cell metabolism and uncovered a new function in regulation of alternative splicing, two events that can contribute to tumor development. The data may provide new targets for pharmacological modulation of RAC1B expression and cellular metabolism, with potential impact for the treatment of cancer and type 2 diabetes.
A regulação da entrada de glucose para o interior da célula é um mecanismo chave no que respeita à manutenção da homeostase celular e do corpo como um todo. Esta regulação passa pela localização dos canais transportadores de glucose (GLUT) que, entre outros canais, são os principais responsáveis pela entrada de glucose. Além dos níveis de expressão dos transportadores GLUT, a sua inserção na membrana plasmática (PM) é regulada por mecanismos de sinalização que determinam a translocação de vesículas intracelulares contendo estes transportadores. O mecanismo regulatório da localização do transportador GLUT4 melhor caracterizado é o da resposta à insulina. Este envolve a ativação do recetor de insulina e a cascata de sinalização das cinases PI3K/AKT, levando à inativação da proteína reguladora do tráfego membranar TBC1D4 (do inglês: Tre-2/USP6, BUB2, Cdc16 domain family member 4), que assim permite a ativação de GTPases da família Rab (RabGAP) que promovem a translocação de vesículas e o aumento da expressão de GLUT4 na membrana. A fosforilação de TBC1D4, bem como da proteína paráloga TBC1D1, é um passo chave para a regulação da localização dos canais GLUT na membrana. Trabalhos anteriores do laboratório de acolhimento revelaram que a proteína cinase WNK1 [do inglês: with no K (K=lysine) 1] modula a localização do transportador GLUT1 na membrana plasmática. WNK1 tem a capacidade de fosforilar a TBC1D4, inibindo a sua atividade RAB-GAP o que permite a translocação de vesiculas de transportadores GLUT1 para a membrana plasmática através da ativação da proteína Rab8A. O objetivo desta tese foi identificar novos locais de fosforilação nas proteínas reguladoras da localização de GLUT1, TBC1D1 e TBC1D4. Comparámos por espetrometria de massa os locais de fosforilação em TBC1D1 e TBC1D4 reguladas in vitro pelas cinases AKT, WNK1, SGK1 e SGK3. Encontrámos dois novos locais de fosforilação regulados pela cinase WNK1, uma serina na posição 565 (Ser565) em TBC1D1 e uma serina na posição 704 (Ser704) em TBC1D4. Ao expressar mutantes dos resíduos Ser565 em TBC1D1 e Ser704 em TBC1D4 foi possível concluir que a fosforilação destes locais regula a prevalência de GLUT1 à superfície das células. O mutante que mimetiza o estado não fosforilado causou, em ambos os casos (Ser565 em TBC1D1 e Ser704 em TBC1D4) uma redução significativa da quantidade de GLUT1 na membrana plasmática. Esta diminuição foi comparável ao nível observado nas células aquando da depleção da cinase WNK1. Concordantemente, a transfeção dos mutantes que mimetizam o estado fosforilado dos locais mostrou, em ambos os casos, que estes causam uma manutenção da quantidade de transportador de glucose GLUT1 na membrana, apesar da depleção da proteína cinase WNK1 que induz a perda de expressão de GLUT1 à superfície. Demonstrou-se então, que locais especificamente fosforilados pela cinase WNK1 nas proteínas TBC1D regulam o metabolismo de glucose, modulando a quantidade de canais transportadores de glucose GLUT1 presentes à superfície das células HEK293. Na pesquisa de locais específicos encontrámos também o resíduo de treonina 505 (Thr505) em TBC1D1 fosforilado especificamente pela cinase SGK1 (do inglês: serum glucocorticoid-inducible protein kinase 1). Contudo, experimentalmente não se verificou uma relação direta entre a fosforilação do local e a quantidade de transportador GLUT1 presente na membrana plasmática. São então necessários mais estudos para entender de que forma esta fosforilação específica de TBC1D1 pode afetar a célula e quais os mecanismos moleculares envolvidos. Seguidamente, tivémos como objetivo encontrar novas proteínas que interagem com WNK1, de forma a escrutinar novas vias de sinalização reguladas por esta proteína cinase. Para tal, isolámos e identificámos as proteínas que compõem os complexos macromoleculares associados à WNK1, recorrendo novamente a técnicas de espectrometria de massa. Os dados obtidos foram primeiro sujeitos a uma análise bioinformática do nível de confiança (CCS do inglês: combined confidence score) de forma a eliminar interações não específicas. A subsequente análise, por ontologia génica das proteínas candidatas indicou uma relação da cinase WNK1 com o processamento de RNA-mensageiro. De facto, a validação experimental dos candidatos confirmou a existência de um complexo proteico entre WNK1 e três proteínas cujas funções estão ligadas à regulação de splicing alternativo, em dois modelos celulares distintos (a linha celular estabelecida de células embrionárias de rim, HEK293 e a de cancro colorretal, HT29). Designadamente, as proteínas GSK3β (do inglês: glycogen synthase kinase 3 beta), SRPK1 (do inglês: SRFS protein kinase 1) e SRSF1 (do inglês: serine/argininerich splicing factor 1). Dado que os alvos validados (GSK3β, SRPK1 e SRSF1) estão envolvidos na expressão de RAC1B, um produto do processamento alternativo de RNA mensageiro, testámos qual a influência da expressão da cinase WNK1 na expressão de RAC1B. Verificámos que a depleção de WNK1 em células HT29, um modelo de carcinoma colorretal, levou a uma significativa diminuição da expressão de RAC1B. Tomando partido do conhecimento de que a droga anti-inflamatória Ibuprofeno (IBU) tem como um dos efeitos a diminuição da expressão de RAC1B em células HT29, fomos testar o envolvimento de WNK1 nesta diminuição. Os nossos resultados sugerem que a interação com WNK1 protege a cinase GSK3β de ser inativada, através de fosforilação da serina na posição 9 (Ser9). Verificámos que o tratamento com IBU altera a capacidade de interação entre as proteínas WNK1, GSK3β e SRPK1. Apurámos, ainda, que quer o tratamento com IBU, quer a depleção de WNK1, em células HT29 causam uma diminuição da expressão de RAC1B associada a um aumento da fosforilação de GSK3β na Ser9. Através de tratamento com IBU ou depleção de WNK1 seguidos de depleção da cinase AKT1 verificámos que a fosforilação de GSK3β na Ser9 é, pelo menos em parte, levada a cabo pela AKT1. Quando no núcleo, SRSF1 promove a inclusão de um exão adicional normalmente excluído, o que leva à expressão de RAC1B. Fomos, então, testar de que forma os tratamentos IBU e depleção de WNK1 levariam a uma alteração na localização celular das proteínas SRPK1 e SRSF1. Por imunofluorescência, observámos que células tratadas com IBU em que a expressão de WNK1 foi silenciada, ocorre uma diminuição da intensidade do sinal nuclear correspondente a SRPK1 e SRSF1. De forma a verificar se esta alteração de localização era dependente de GSK3β, repetimos os tratamentos IBU e depleção de WNK1 em células transfetadas com um mutante não fosforilável na Ser9 de GSK3β, proveniente da substituição de uma serina por um resíduo de alanina na posição 9 [GSK3β (S9A)]. Apurámos que as células transfetadas com o mutante GSK3β (S9A) são resistentes ao efeito do tratamento com IBU ou depleção de WNK1, levando a uma relocalização de SRPK1 e SRSF1 para o núcleo. Deste modo, verificámos que a forma ativa de GSK3β é determinante na localização nuclear de SRPK1 e SRSF1. Por fim, e de forma a verificar se ambos os efeitos de WNK1 estavam relacionados, fomos comparar o efeito da depleção de WNK1 ou de RAC1B na capacidade de absorção de glucose em células HT29. Os nossos resultados indicam que apenas a depleção de WNK1 causa uma diminuição significativa na absorção de glucose, ao mesmo tempo que causa uma diminuição da expressão de RAC1B. Por sua vez, o silenciamento da expressão de RAC1B parece não causar um efeito na absorção de glucose nas células tumorais. Estes resultados indicam que os dois efeitos de WNK1 estudados neste trabalho são independentes. Em conclusão, os nossos resultados reforçam a importância de WNK1 no metabolismo de glucose e identificaram ainda uma nova via em que a cinase WNK1 regula processos de processamento alternativo de RNA. Ambos os efeitos podem ter um papel no desenvolvimento tumoral. Estes resultados podem providenciar novos alvos de modulação farmacológica da expressão de RAC1B ou do metabolismo de glucose com potencial impacto no combate de doenças como cancro e diabetes tipo 2.
A regulação da entrada de glucose para o interior da célula é um mecanismo chave no que respeita à manutenção da homeostase celular e do corpo como um todo. Esta regulação passa pela localização dos canais transportadores de glucose (GLUT) que, entre outros canais, são os principais responsáveis pela entrada de glucose. Além dos níveis de expressão dos transportadores GLUT, a sua inserção na membrana plasmática (PM) é regulada por mecanismos de sinalização que determinam a translocação de vesículas intracelulares contendo estes transportadores. O mecanismo regulatório da localização do transportador GLUT4 melhor caracterizado é o da resposta à insulina. Este envolve a ativação do recetor de insulina e a cascata de sinalização das cinases PI3K/AKT, levando à inativação da proteína reguladora do tráfego membranar TBC1D4 (do inglês: Tre-2/USP6, BUB2, Cdc16 domain family member 4), que assim permite a ativação de GTPases da família Rab (RabGAP) que promovem a translocação de vesículas e o aumento da expressão de GLUT4 na membrana. A fosforilação de TBC1D4, bem como da proteína paráloga TBC1D1, é um passo chave para a regulação da localização dos canais GLUT na membrana. Trabalhos anteriores do laboratório de acolhimento revelaram que a proteína cinase WNK1 [do inglês: with no K (K=lysine) 1] modula a localização do transportador GLUT1 na membrana plasmática. WNK1 tem a capacidade de fosforilar a TBC1D4, inibindo a sua atividade RAB-GAP o que permite a translocação de vesiculas de transportadores GLUT1 para a membrana plasmática através da ativação da proteína Rab8A. O objetivo desta tese foi identificar novos locais de fosforilação nas proteínas reguladoras da localização de GLUT1, TBC1D1 e TBC1D4. Comparámos por espetrometria de massa os locais de fosforilação em TBC1D1 e TBC1D4 reguladas in vitro pelas cinases AKT, WNK1, SGK1 e SGK3. Encontrámos dois novos locais de fosforilação regulados pela cinase WNK1, uma serina na posição 565 (Ser565) em TBC1D1 e uma serina na posição 704 (Ser704) em TBC1D4. Ao expressar mutantes dos resíduos Ser565 em TBC1D1 e Ser704 em TBC1D4 foi possível concluir que a fosforilação destes locais regula a prevalência de GLUT1 à superfície das células. O mutante que mimetiza o estado não fosforilado causou, em ambos os casos (Ser565 em TBC1D1 e Ser704 em TBC1D4) uma redução significativa da quantidade de GLUT1 na membrana plasmática. Esta diminuição foi comparável ao nível observado nas células aquando da depleção da cinase WNK1. Concordantemente, a transfeção dos mutantes que mimetizam o estado fosforilado dos locais mostrou, em ambos os casos, que estes causam uma manutenção da quantidade de transportador de glucose GLUT1 na membrana, apesar da depleção da proteína cinase WNK1 que induz a perda de expressão de GLUT1 à superfície. Demonstrou-se então, que locais especificamente fosforilados pela cinase WNK1 nas proteínas TBC1D regulam o metabolismo de glucose, modulando a quantidade de canais transportadores de glucose GLUT1 presentes à superfície das células HEK293. Na pesquisa de locais específicos encontrámos também o resíduo de treonina 505 (Thr505) em TBC1D1 fosforilado especificamente pela cinase SGK1 (do inglês: serum glucocorticoid-inducible protein kinase 1). Contudo, experimentalmente não se verificou uma relação direta entre a fosforilação do local e a quantidade de transportador GLUT1 presente na membrana plasmática. São então necessários mais estudos para entender de que forma esta fosforilação específica de TBC1D1 pode afetar a célula e quais os mecanismos moleculares envolvidos. Seguidamente, tivémos como objetivo encontrar novas proteínas que interagem com WNK1, de forma a escrutinar novas vias de sinalização reguladas por esta proteína cinase. Para tal, isolámos e identificámos as proteínas que compõem os complexos macromoleculares associados à WNK1, recorrendo novamente a técnicas de espectrometria de massa. Os dados obtidos foram primeiro sujeitos a uma análise bioinformática do nível de confiança (CCS do inglês: combined confidence score) de forma a eliminar interações não específicas. A subsequente análise, por ontologia génica das proteínas candidatas indicou uma relação da cinase WNK1 com o processamento de RNA-mensageiro. De facto, a validação experimental dos candidatos confirmou a existência de um complexo proteico entre WNK1 e três proteínas cujas funções estão ligadas à regulação de splicing alternativo, em dois modelos celulares distintos (a linha celular estabelecida de células embrionárias de rim, HEK293 e a de cancro colorretal, HT29). Designadamente, as proteínas GSK3β (do inglês: glycogen synthase kinase 3 beta), SRPK1 (do inglês: SRFS protein kinase 1) e SRSF1 (do inglês: serine/argininerich splicing factor 1). Dado que os alvos validados (GSK3β, SRPK1 e SRSF1) estão envolvidos na expressão de RAC1B, um produto do processamento alternativo de RNA mensageiro, testámos qual a influência da expressão da cinase WNK1 na expressão de RAC1B. Verificámos que a depleção de WNK1 em células HT29, um modelo de carcinoma colorretal, levou a uma significativa diminuição da expressão de RAC1B. Tomando partido do conhecimento de que a droga anti-inflamatória Ibuprofeno (IBU) tem como um dos efeitos a diminuição da expressão de RAC1B em células HT29, fomos testar o envolvimento de WNK1 nesta diminuição. Os nossos resultados sugerem que a interação com WNK1 protege a cinase GSK3β de ser inativada, através de fosforilação da serina na posição 9 (Ser9). Verificámos que o tratamento com IBU altera a capacidade de interação entre as proteínas WNK1, GSK3β e SRPK1. Apurámos, ainda, que quer o tratamento com IBU, quer a depleção de WNK1, em células HT29 causam uma diminuição da expressão de RAC1B associada a um aumento da fosforilação de GSK3β na Ser9. Através de tratamento com IBU ou depleção de WNK1 seguidos de depleção da cinase AKT1 verificámos que a fosforilação de GSK3β na Ser9 é, pelo menos em parte, levada a cabo pela AKT1. Quando no núcleo, SRSF1 promove a inclusão de um exão adicional normalmente excluído, o que leva à expressão de RAC1B. Fomos, então, testar de que forma os tratamentos IBU e depleção de WNK1 levariam a uma alteração na localização celular das proteínas SRPK1 e SRSF1. Por imunofluorescência, observámos que células tratadas com IBU em que a expressão de WNK1 foi silenciada, ocorre uma diminuição da intensidade do sinal nuclear correspondente a SRPK1 e SRSF1. De forma a verificar se esta alteração de localização era dependente de GSK3β, repetimos os tratamentos IBU e depleção de WNK1 em células transfetadas com um mutante não fosforilável na Ser9 de GSK3β, proveniente da substituição de uma serina por um resíduo de alanina na posição 9 [GSK3β (S9A)]. Apurámos que as células transfetadas com o mutante GSK3β (S9A) são resistentes ao efeito do tratamento com IBU ou depleção de WNK1, levando a uma relocalização de SRPK1 e SRSF1 para o núcleo. Deste modo, verificámos que a forma ativa de GSK3β é determinante na localização nuclear de SRPK1 e SRSF1. Por fim, e de forma a verificar se ambos os efeitos de WNK1 estavam relacionados, fomos comparar o efeito da depleção de WNK1 ou de RAC1B na capacidade de absorção de glucose em células HT29. Os nossos resultados indicam que apenas a depleção de WNK1 causa uma diminuição significativa na absorção de glucose, ao mesmo tempo que causa uma diminuição da expressão de RAC1B. Por sua vez, o silenciamento da expressão de RAC1B parece não causar um efeito na absorção de glucose nas células tumorais. Estes resultados indicam que os dois efeitos de WNK1 estudados neste trabalho são independentes. Em conclusão, os nossos resultados reforçam a importância de WNK1 no metabolismo de glucose e identificaram ainda uma nova via em que a cinase WNK1 regula processos de processamento alternativo de RNA. Ambos os efeitos podem ter um papel no desenvolvimento tumoral. Estes resultados podem providenciar novos alvos de modulação farmacológica da expressão de RAC1B ou do metabolismo de glucose com potencial impacto no combate de doenças como cancro e diabetes tipo 2.
Description
Tese de doutoramento em Biologia (Biologia de Sistemas), apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019.
Keywords
Glucose Uptake WNK1 Proten Phosphorylation Cancer Cell Splicing Factor Cell Metabolism Protein Interaction Tumorigenesis Metabolismo Celular Fosforilação de Proteínas Interação Proteica Tumorigénese Vias de Transdução de Sinal e Patologias Associadas