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Regulation of epithelial chloride transport by phospho-tyrosine-initiated protein networks
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Abstract(s)
Ion transport is crucial for cell volume regulation by compensating variations in extracellular tonicity, playing an important role in maintaining the structural integrity and intracellular milieu in cells. These functions require a dynamic, spatio-temporally coordinated regulation of ion transport, which occurs in cells by two mechanisms: first, the amount of channel or cotransporter inserted into the plasma membrane (PM) from a pool of endosomal storage vesicles, and second, the ion transport activity regulated by post-translational modifications such as phosphorylation of channel or transporter proteins. Previous results from the host laboratory showed that phosphorylation by spleen tyrosine kinase (SYK) of Tyr512 in the NBD1 domain regulates PM abundance of CFTR, the chloride channel involved in cystic fibrosis. The main objective of this PhD project was to identify phospho-tyrosine-binding proteins involved in the regulation of chloride transport proteins and the underlying molecular mechanism. First, it was found that besides CFTR two further renal ion cotransporters, NKCC2 and KCC3, are phosphorylated by SYK in vitro on an N-terminal tyrosine residue and that experimental manipulation of either SYK expression levels or its catalytic activity affect the cell surface abundance of these cotransporters. Interestingly, the very same phosphorylation pathway leads to a decrease in NKCC2 but to an increase in KCC3 PM levels. Second, the underlying biochemical mechanism was identified using peptide pulldown assays followed by mass spectrometry and revealed that the adaptor protein SHC1 binds to phospho-tyrosine in NKCC2, KCC3 and CFTR through its PTB domain. Upon depletion of endogenous SHC1 expression, KCC3 decreased at the PM, whereas NKCC2 and CFTR levels increased. In the case of phosphorylated NKCC2, SNX27 and NCK1 were identified as additional binding partners. Lastly, SHC1 was shown to form a complex with CFTR following activation of protein kinase SYK, but does not affect the PM level of the most frequent mutant F508del-CFTR. The results described in this work identified a novel SYK/SHC1 pathway that regulates the cotransporters NKCC2 and KCC3 and the chloride channel CFTR and have potential biomedical implications for the identification of new therapeutic targets in diseases like hypertension or cystic fibrosis, or those involving regulation of cell volume.
O transporte iónico é fundamental para a sobrevivência das células, porque permite a reabsorção de inúmeras moléculas essenciais, bem como a secreção de produtos do metabolismo celular. Como tal desempenha um papel importante na manutenção da integridade metabólica e do meio intracelular nas células epiteliais. Sendo assim é necessário uma regulação e coordenação dinâmica do transporte iónico, capaz de responder a alterações no microambiente celular. Esta resposta pode ser concebida pelo controlo do número de canais ou cotransportadores presentes na membrana plasmática (MP). Adicionalmente, modificações pós-traducionais como a fosforilação de canais e transportadores podem também alterar a sua atividade de transporte. Desta forma, alterações ou defeitos na regulação de proteínas de transporte iónico afetam o volume celular, o potencial eletro-osmótico da membrana ou a interação com recetores ou outras proteínas e estão associados a diversas patologias, como por exemplo a hipertensão arterial ou o cancro, mas também doenças genéticas raras como fibrose quística (FQ). Todavia, o transporte membranar, incluindo canais iónicos e transportadores, são alvos terapêuticos para estas patologias. Anteriormente, o laboratório de acolhimento demonstrou que a proteína cinase SYK (spleen tyrosine kinase) regula o canal CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), canal de cloreto envolvido na FQ. A FQ é uma das doenças genéticas mais comuns, afetando aproximadamente 70.000 pessoas em todo o mundo, com maior expressão na população caucasiana. A doença é causada por mutações que ocorrem num único gene, o gene CFTR, o qual codifica um canal de cloreto. Mutações neste canal levam a um défice na secreção de cloreto no epitélio, causando um desequilíbrio eletrolítico que provoca várias manifestações sistémicas, especialmente a nível pulmonar e gastrointestinal. Em particular, uma deleção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 (Phe508) é a mutação mais frequente. Na proximidade deste local o resíduo de tirosina 512 (Tyr512), no domínio NBD1 do canal CFTR, foi demonstrado ser fosforilado pela SYK in vitro, e de inibir a quantidade de CFTR presente na MP, sem afetar os níveis totais da CFTR, aquando da expressão da SYK em células BHK-21. Ao mutar o resíduo Tyr512 foi possível concluir que a sua fosforilação é um novo sinal que regula a prevalência da CFTR à superfície das células. No entanto, o mecanismo molecular envolvido permaneceu desconhecido. Neste contexto, o objetivo desta dissertação foi identificar proteínas que interagem com a CFTR fosforilada pela SYK e o mecanismo molecular envolvido na modulação da presença de CFTR na MP, bem como identificar se outros canais ou cotransportadores também são regulados pela cinase SYK. Em primeiro lugar, foi analisado a presença do motivo de consenso da cinase SYK nas sequências de 20 proteínas envolvidas no transporte de sódio, potássio e cloreto. Este motivo peptídico específico foi, por sua vez, encontrado na sequência de apenas dois canais iónicos: NKCC2 e KCC3. Ambos pertencem á família de cotransportadores de catiões e cloretos (solute carrier family 12- SLC12). NKCC2 está envolvido na reabsorção de sódio e cloreto na membrana apical das células do ramo ascendente da ansa de Henle. Mutações que levam a uma perda de função do NKCC2 provocam uma deficiente reabsorção de sal causando o Síndrome de Bartter tipo 1. Devido á sua função, o NKCC2 é alvo de fármacos diuréticos para a regulação da hipertensão arterial. Por outro lado, KCC3 é sobretudo expresso na membrana basolateral de células do nefrónio, no colon e em neurónios e está envolvido na regulação do volume celular. Ambos os cotransportadores são importantes para a homeostase eletrolítica nos rins e na manutenção da pressão arterial. Seguidamente, verificou-se que os cotransportadores NKCC2 e KCC3 são fosforilados in vitro pela cinase SYK no resíduo de tirosina que se encontra no domínio N-terminal. Para além disso, experiências manipulando quer os níveis de expressão da SYK quer a sua atividade catalítica demonstraram que esta cinase afeta os níveis de cotransportadores presentes à superfície das células HEK293. Em particular, verificou-se que a mesma via de fosforilação promove uma diminuição da expressão do NKCC2 à superfície, enquanto que no KCC3 possui o efeito oposto. Uma vez que a fosforilação em resíduos de tirosina pode criar locais de ligação para outras proteínas adaptadores, o nosso objetivo seguinte foi identificar os mecanismos bioquímicos envolvidos na regulação de NKCC2, KCC3 e CFTR fosforilados pela cinase SYK. Para este fim, desenharam-se péptidos sintéticos com a respetiva tirosina fosforilada para a sequência de cada canal ou cotransportador. Cada péptido contem uma modificação de biotina para se poder ligar a uma matriz de estreptavidina e foram sintetizados na sua forma ativa (tirosina fosforilada), controlo (tirosina não fosforilada) e mutante (substituição do resíduo de tirosina por fenilalanina). Foram realizados ensaios de pull-down com lisados de linhas celulares que expressam endogenamente os respetivos canais, seguidos por identificação das proteínas captadas por espectrometria de massa. Usando ferramentas bioinformáticas e tendo como base as interações proteicas descritas entre cada canal e a cinase SYK, identificamos várias proteínas enriquecidas, das quais a proteína adaptadora SHC1 foi validada como um modulador da quantidade dos cotransportadores inseridos na MP. Nomeadamente, ao proceder-se ao silenciamento da SHC1 por interferência de RNA, verificou-se um aumento substancial na abundância na MP do NKCC2 e da CFTR, mas uma diminuição dos níveis de KCC3 na superfície das células. Para além disso, demonstramos ainda que a fosforilação do NKCC2 pela SYK promove a ligação das proteínas SNX27 e NCK1. Seguidamente, demonstrámos que a via SYK/SHC1 regula a abundância na MP da wt-CFTR. Manipulando quer os níveis de expressão da SYK quer a sua atividade catalítica ou a diminuição dos níveis endógenos da SHC1, observámos alterações dos níveis de CFTR na MP. Por fim, demonstrámos que a proteína adaptadora SHC1 forma um complexo com a wt-CFTR quando esta é fosforilada pela SYK. Notavelmente, o efeito induzido na wt-CFTR pela SHC1 e pela SYK, não se verificou no mutante F508delCFTR. Em resumo, esta dissertação identificou e caracterizou proteínas envolvidas na regulação do canal de cloreto CFTR e cotransportadores NKCC2 e KCC3 e permitiu a identificação da via SYK/SHC1. Estes resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos de regulação dos referidos transportadores de cloreto e poderão permitir a identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento da hipertensão arterial ou da fibrose quística, bem como na regulação do volume celular.
O transporte iónico é fundamental para a sobrevivência das células, porque permite a reabsorção de inúmeras moléculas essenciais, bem como a secreção de produtos do metabolismo celular. Como tal desempenha um papel importante na manutenção da integridade metabólica e do meio intracelular nas células epiteliais. Sendo assim é necessário uma regulação e coordenação dinâmica do transporte iónico, capaz de responder a alterações no microambiente celular. Esta resposta pode ser concebida pelo controlo do número de canais ou cotransportadores presentes na membrana plasmática (MP). Adicionalmente, modificações pós-traducionais como a fosforilação de canais e transportadores podem também alterar a sua atividade de transporte. Desta forma, alterações ou defeitos na regulação de proteínas de transporte iónico afetam o volume celular, o potencial eletro-osmótico da membrana ou a interação com recetores ou outras proteínas e estão associados a diversas patologias, como por exemplo a hipertensão arterial ou o cancro, mas também doenças genéticas raras como fibrose quística (FQ). Todavia, o transporte membranar, incluindo canais iónicos e transportadores, são alvos terapêuticos para estas patologias. Anteriormente, o laboratório de acolhimento demonstrou que a proteína cinase SYK (spleen tyrosine kinase) regula o canal CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), canal de cloreto envolvido na FQ. A FQ é uma das doenças genéticas mais comuns, afetando aproximadamente 70.000 pessoas em todo o mundo, com maior expressão na população caucasiana. A doença é causada por mutações que ocorrem num único gene, o gene CFTR, o qual codifica um canal de cloreto. Mutações neste canal levam a um défice na secreção de cloreto no epitélio, causando um desequilíbrio eletrolítico que provoca várias manifestações sistémicas, especialmente a nível pulmonar e gastrointestinal. Em particular, uma deleção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 (Phe508) é a mutação mais frequente. Na proximidade deste local o resíduo de tirosina 512 (Tyr512), no domínio NBD1 do canal CFTR, foi demonstrado ser fosforilado pela SYK in vitro, e de inibir a quantidade de CFTR presente na MP, sem afetar os níveis totais da CFTR, aquando da expressão da SYK em células BHK-21. Ao mutar o resíduo Tyr512 foi possível concluir que a sua fosforilação é um novo sinal que regula a prevalência da CFTR à superfície das células. No entanto, o mecanismo molecular envolvido permaneceu desconhecido. Neste contexto, o objetivo desta dissertação foi identificar proteínas que interagem com a CFTR fosforilada pela SYK e o mecanismo molecular envolvido na modulação da presença de CFTR na MP, bem como identificar se outros canais ou cotransportadores também são regulados pela cinase SYK. Em primeiro lugar, foi analisado a presença do motivo de consenso da cinase SYK nas sequências de 20 proteínas envolvidas no transporte de sódio, potássio e cloreto. Este motivo peptídico específico foi, por sua vez, encontrado na sequência de apenas dois canais iónicos: NKCC2 e KCC3. Ambos pertencem á família de cotransportadores de catiões e cloretos (solute carrier family 12- SLC12). NKCC2 está envolvido na reabsorção de sódio e cloreto na membrana apical das células do ramo ascendente da ansa de Henle. Mutações que levam a uma perda de função do NKCC2 provocam uma deficiente reabsorção de sal causando o Síndrome de Bartter tipo 1. Devido á sua função, o NKCC2 é alvo de fármacos diuréticos para a regulação da hipertensão arterial. Por outro lado, KCC3 é sobretudo expresso na membrana basolateral de células do nefrónio, no colon e em neurónios e está envolvido na regulação do volume celular. Ambos os cotransportadores são importantes para a homeostase eletrolítica nos rins e na manutenção da pressão arterial. Seguidamente, verificou-se que os cotransportadores NKCC2 e KCC3 são fosforilados in vitro pela cinase SYK no resíduo de tirosina que se encontra no domínio N-terminal. Para além disso, experiências manipulando quer os níveis de expressão da SYK quer a sua atividade catalítica demonstraram que esta cinase afeta os níveis de cotransportadores presentes à superfície das células HEK293. Em particular, verificou-se que a mesma via de fosforilação promove uma diminuição da expressão do NKCC2 à superfície, enquanto que no KCC3 possui o efeito oposto. Uma vez que a fosforilação em resíduos de tirosina pode criar locais de ligação para outras proteínas adaptadores, o nosso objetivo seguinte foi identificar os mecanismos bioquímicos envolvidos na regulação de NKCC2, KCC3 e CFTR fosforilados pela cinase SYK. Para este fim, desenharam-se péptidos sintéticos com a respetiva tirosina fosforilada para a sequência de cada canal ou cotransportador. Cada péptido contem uma modificação de biotina para se poder ligar a uma matriz de estreptavidina e foram sintetizados na sua forma ativa (tirosina fosforilada), controlo (tirosina não fosforilada) e mutante (substituição do resíduo de tirosina por fenilalanina). Foram realizados ensaios de pull-down com lisados de linhas celulares que expressam endogenamente os respetivos canais, seguidos por identificação das proteínas captadas por espectrometria de massa. Usando ferramentas bioinformáticas e tendo como base as interações proteicas descritas entre cada canal e a cinase SYK, identificamos várias proteínas enriquecidas, das quais a proteína adaptadora SHC1 foi validada como um modulador da quantidade dos cotransportadores inseridos na MP. Nomeadamente, ao proceder-se ao silenciamento da SHC1 por interferência de RNA, verificou-se um aumento substancial na abundância na MP do NKCC2 e da CFTR, mas uma diminuição dos níveis de KCC3 na superfície das células. Para além disso, demonstramos ainda que a fosforilação do NKCC2 pela SYK promove a ligação das proteínas SNX27 e NCK1. Seguidamente, demonstrámos que a via SYK/SHC1 regula a abundância na MP da wt-CFTR. Manipulando quer os níveis de expressão da SYK quer a sua atividade catalítica ou a diminuição dos níveis endógenos da SHC1, observámos alterações dos níveis de CFTR na MP. Por fim, demonstrámos que a proteína adaptadora SHC1 forma um complexo com a wt-CFTR quando esta é fosforilada pela SYK. Notavelmente, o efeito induzido na wt-CFTR pela SHC1 e pela SYK, não se verificou no mutante F508delCFTR. Em resumo, esta dissertação identificou e caracterizou proteínas envolvidas na regulação do canal de cloreto CFTR e cotransportadores NKCC2 e KCC3 e permitiu a identificação da via SYK/SHC1. Estes resultados contribuem para a compreensão dos mecanismos de regulação dos referidos transportadores de cloreto e poderão permitir a identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento da hipertensão arterial ou da fibrose quística, bem como na regulação do volume celular.
Description
Tese de doutoramento em Biologia (Biologia de Sistemas), apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019.
Tese orientada por: Doutor Peter Jordan (Orientador) e Doutor Luka Clarke (Co-orientador).
Tese orientada por: Doutor Peter Jordan (Orientador) e Doutor Luka Clarke (Co-orientador).
Keywords
Protein Phosphorylation SYK CFTR NKCC2 KCC3 Fosforilação de Proteínas Transporte de Cloreto Hipertensão Fibrose Quística Vias de Transdução de Sinal e Patologias Associadas