DGH - Apresentações orais em encontros internacionais
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Percorrer DGH - Apresentações orais em encontros internacionais por Domínios Científicos e Tecnológicos (FOS) "Ciências Médicas"
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- An engineered U1 snRNA-based therapeutic approach can efficiently rescue a 5’ splice site mutation causing Mucolipidosis type IIIPublication . Peretto, L.; Gonçalves, M.; Santos, J.I.; Duarte, A.J.; Moreira, L.; Encarnação, M; Coutinho, M.F.; Pinotti, M.; Balestra, D.; Alves, S.; Matos. L.A significant number of splicing mutations have been identified in Lysosomal Storage Disorders (LSDs). Mucolipidosis III (ML III) is a LSD caused by GlcNAc-1-phosphotransferase deficiency, which impairs the trafficking of lysosomal hydrolases. 10% of the genetic defects in ML III are splicing mutations, and around 45% affect 5' splice-sites (ss) thus constituting a good target for mutation specific therapies. The use of engineered U1 snRNA (either modified U1 snRNAs or exon-specific U1s - ExSpeU1s) has been applied as a potential therapeutic strategy to correct 5’ss defects. Here we used engineered U1 snRNAs to correct the GNPTAB exon 17 skipping caused by the 5’ss mutation (c.3335+6T>G) found in a ML III patient. First, we performed transfection of exon-trapping minigenes expressing exon 17 surrounded by a portion of introns - pGNPTAB_WT and pGNPTAB_+6, in HEK293T cells to analyze if they reproduce the WT and mutant splicing patterns. Then, to evaluate the potential of 2 modified U1’s, 3 ExSpeU1s and 2 modified U6’s to restore mRNA splicing, these vectors were cotransfected into HEK293T cells along with the mutant +6 minigene as well as electroporated in patient’s fibroblasts. Then, cells were harvested, and RT-PCR analysis was performed. Both minigenes reproduced the control or ML III patient cDNA’s splicing patterns, thus, different concentrations of the modified U1’s and ExSpeU1s were tested together with the mutant minigene. The cDNA analysis showed almost 100% of exon 17 inclusion when one of the ExSpeU1s, was overexpressed in HEK293T cells. The combination of the 2 modified U6’s with the modified U1’s or the ExSpeU1s allowed exon 17 inclusion at some extent, but not as effectively as with the best ExSpeU1 alone. The electroporation of the 2 modified U1’s and of the 3 ExSpeU1s was done, and the cDNA analysis of patient’s fibroblasts treated with 2 ExSpeU1s (ExSpeU1 int17-1 or int17-2) showed around 35% and 15% of exon 17-including transcripts, respectively. To confirm these results, given that the lentiviral transduction is a more efficient delivery technique than electroporation, the gene cassettes of the 2 most promising ExSpeU1s were cloned in a lentivirus vector and after obtaining the viral mediums, their transduction in patient’s fibroblasts is being optimized. The cDNA analysis of preliminary experiments is still ongoing. In conclusion, we have developed an RNA therapy based on engineered U1 snRNAs for a ML III 5’ss mutation. We showed that an ExSpeU1 (binding downstream of the mutated 5´ss) can restore proper exon 17 definition in vitro, opening the opportunity for a personalized therapeutic intervention.
- Hemocromatose - causa genética ou adquirida?Publication . Faustino, PaulaNesta comunicação oral apresentam-se e discutem-se as possíveis causas responsáveis pela a hemocromatose adquirida e genética e os seus diversos tipos. Explicam-se os principias mecanismos de absorção e reciclagem do ferro no Homem e a atuação da principal hormona responsável pela regulação dos níveis de ferro no organismo. Apresentam-se os biomarcadores bioquímicos usados no diagnóstico da doença e os métodos moleculares usados para caracterizar os genótipos de risco. Debate-se a penetrância e elevada variabilidade da doença e os seus fatores modificadores. Apresenta-se trabalho de investigação realizado no Departamento de Genética Humana do INSA no âmbito destas patologias.
- Hemoglobinopatias - InvestigaçãoPublication . Faustino, PaulaNesta comunicação oral apresentam-se as recomendações da OMS para combater a drepanocitose nos países Africanos e o papel da investigação para compreender os mecanismos da doença e desenvolver estratégias terapêuticas para a combater. Apresentam-se os fatores genéticos modificadores da doença, nomeadamente o nível de hemoglobina fetal e como esta pode ser manipulada farmacologicamente para benefício do doente. Mostram-se e discutem-se os resultados dos trabalhos de investigação de âmbito colaborativo desenvolvidos entre o INSA e algumas Instituições de Saúde Angolanas na área dos fatores genéticos modificadores das manifestações da drepanocitose. Discutem-se os tratamentos sintomáticos e os curativos, incluindo a terapia génica, e os obstáculos às suas utilizações em África.
- Influência da genética do metabolismo do ferro nos fenótipos bioquímicos e hematológicos da insuficiência cardíacaPublication . Bicho, Manuel; Aguiar, Laura; Matias, Ana; Santos, Mafalda; Barbosa, Mário; Melício, Ana; Menezes Falcão, Luiz; Faustino, Paula; Inácio, ÂngelaIntrodução: A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome que se caracteriza pela incapacidade do coração bombear sangue de forma eficiente para atender às necessidades metabólicas do organismo humano. Esta patologia multifatorial, frequentemente associada a deficiência de ferro e anemia, pode ser influenciada por diversos moduladores, entre estes, genes responsáveis pelo equilíbrio do metabolismo do ferro. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo investigar a contribuição da variação genética em genes relacionados com o metabolismo do ferro, nomeadamente HFE, SLC40A1 e TMPRSS6, para os fenótipos bioquímicos e hematológicos relacionados com a cinética do ferro na IC no geral, na IC com fração de ejeção preservada (ICFEp) e na IC com fração de ejeção não preservada (ICFEnp), considerando as diferenças entre os sexos. Material e Métodos: O estudo englobou uma amostra populacional de 192 indivíduos com IC, com idades compreendidas entre os 35 e os 99 anos (mediana de 84 anos). A análise das variantes em estudo do gene HFE foi realizada através da técnica PCR-ARMS Multiplex. As análises dos restantes polimorfismos foram realizadas através da técnica Endpoint-Genotyping. Os parâmetros bioquímicos e hematológicos estudados (ferro sérico, ferritina, saturação da transferrina, hemoglobina, volume globular médio, Red Cell Distribution Width e capacidade total de fixação do ferro) foram recolhidos dos registos hospitalares dos doentes. A análise estatística foi realizada recorrendo ao software SPSS 28, sendo considerado o nível de significância estatística de p<0,05. Resultados: Neste estudo, a população com IC apresentou anemia ferropénica com baixos níveis de saturação de transferrina. Nos homens, o ferro sérico e o RDW também se apresentaram alterados. Diferenças significativas na presença do genótipo ou alelo variante foram encontradas para os parâmetros bioquímicos ou hematológicos estudados. Para os valores de ferro sérico foram encontradas diferenças significativas associadas a polimorfismos localizados nos três genes estudados. Quanto à ferritina, foram observadas diferenças significativas no HFE_H63D em mulheres e em homens e no SLC40A1_rs2304704 em mulheres, mais especificamente em mulheres com ICFEp. Para a saturação de transferrina, diferenças significativas foram encontradas no polimorfismo HFE_H63D em mulheres e no TMPRSS6_rs855791 em mulheres, particularmente em mulheres com ICFEnp e em homens com ICFEp. Em relação à hemoglobina, foram observadas diferenças significativas para o SLC40A1_rs1439816 em homens. Analisando o VGM, diferenças estatisticamente significativas foram observadas no SLC40A1_rs1439816 em homens com ICFEp e no SLC40A1_rs2304704 em mulheres, e em particular mulheres com ICFEp. Em relação ao RDW, diferenças significativas foram encontradas no polimorfismo C282Y em mulheres com ICFEnp e no polimorfismo H63D em mulheres com ICFEnp e em homens com ICFEp. Para a CTFF, diferenças significativas foram encontradas no rs855791 em mulheres com ICFEp. Conclusão: Este estudo confirmou a presença de indicadores de anemia ferropénica nesta população de indivíduos com IC, destacando a contribuição dos três genes analisados na modulação de fenótipos bioquímicos e hematológicos relacionados com o metabolismo do ferro. Observou-se que estas variantes genéticas têm impacto significativo tanto em homens quanto em mulheres, observando-se também diferenças nos subgrupos da IC com fração de ejeção preservada e não preservada.
- New Zebrafish Models for Mitochondrial DiseasesPublication . Nogueira, Célia; Laranjeira, Mateus; Pinho, Brígida; Marchese, Maria; Pereira, Cristina; Azevedo, L.; Oliveira, J.; Santorelli, Filippo; Vilarinho, LauraIntroduction: Mitochondrial diseases (MD) are rare disorders with clinical and genetic heterogeneity and no effective therapies. Next Generation Sequencing has advanced MD diagnosis, although the interpretation of variants of unknown significance (VUS) remains a challenge (1). Functional validation is crucial for determining VUS pathogenicity, and zebrafish has emerged as a valuable organism to model MD, due to its conserved physiology and genetic similarity to humans. This project aims to functionally characterize four previously identified VUS in ACAD9 and TSFM using zebrafish as an in vivo model.
- Surveillance of invasive meningococcal disease in Portugal, from 2020 to 2024Publication . Bettencourt, Célia; Nunes, A.; VigLab-DM – Network for the Laboratory Surveillance of Meningococcal Disease; Bajanca-Lavado, M.P.; .Introduction: Since 2002, laboratory surveillance of Invasive Meningococcal Disease (IMD) has been carried out by the National Reference Laboratory for Neisseria meningitidis, at the National Institute of Health Doutor Ricardo Jorge, Portugal. This study aims to analyse the epidemiology of IMD and the genetic diversity of Neisseria meningitidis strains from 2020 to 2024. Material and Methods: Suspected IMD cases and N. meningitidis isolates were sent to the reference laboratory for confirmation and strain characterization. Invasive isolates were characterized by WGS (Illumina) and sequences were submitted to the PubMLST/Neisseria database. Results: Between 2020 to 2024, 125 IMD cases were confirmed. Annual incidence rate ranged from 0.36 cases/100,000 inhabitants in 2020 to 0.32 in 2023 [1, 2]. Serogroup B was the most prevalent (49.6%), followed by serogroups Y (14.4%), W (13.6%) and C (5.6%). Serogroup W mainly affected those over 45 years old (58.8%). In silico analysis of 89 (71.2%) isolates identified major clonal complexes (cc): B-cc213 (22%) and cc41/44 (18%), Y-cc23 (80%), W-cc11 (66.7%), and C-cc11/cc103 (33.3% each). Conclusions: Compared to previous studies (2003-2020), the incidence of IMD in Portugal has decreased [1-3]. However, serogroup B remains the leading cause of IMD, raising concerns, particularly due to cases in children and emerging clusters with low vaccination coverage (e.g. serogroup B cc213) [4]. In contrast, serogroup W cases have increased, especially among adults [2, 3]. This study highlights the importance of laboratory surveillance for understanding IMD epidemiology and monitoring long-term trends.
- Translational activation of Δ160p53 is triggered during the Integrated Stress Response to promote survivalPublication . Ramalho, Ana Catarina; López-Iniesta, Maria José; Lacerda, Rafaela; Parkar, Shrutee N.; Romão, Luísa; Candeias, Marco M.The p53 gene was discovered 45 years ago, but to this day some aspects of its regulation and function remain a mystery. This gene encodes for a group of protein isoforms that display different functions, acting cooperatively in stress response. Full-length p53 (FLp53), the best studied isoform, is a transcription factor with targets across several pathways, promoting cellular adaption during stress. Classical roles of FLp53 are the induction of cell cycle arrest and, a as a last resort, apoptosis. The short isoform Δ160p53 is an oncoprotein commonly overexpressed in tumours that can be translated from the same mRNA as FLp531. The exact mechanisms and factors that regulate Δ160p53 translation and how it exerts its pro-survival functions remain unexplored. In this work, it was demonstrated that the translation of Δ160p53 is mediated by an Internal Ribosome Entry Site (IRES) and its expression is induced by the Integrated Stress Response (ISR). Additionally, a mass spectrometry analysis uncovered potential new RNA-binding proteins involved in the translation of Δ160p53, and it was verified that translation factors specifically associated with alternative modes of initiation during the ISR promoted the translation of Δ160p53. In parallel, Δ160p53 was found to interact with FLp53 and modulate its transcriptional activity to favour a pro-survival response to stress. While suppressing genes involved in cell cycle arrest (CDKN1A) and apoptosis (PUMA), Δ160p53 enhances the expression of genes involved in cellular metabolism and protection against ferroptosis: SESN1, SESN2 and SLC7A11. Furthermore, Δ160p53 was shown to suppress ferroptosis and to interact with the SLC7A11 promoter. This study has uncovered new modes of p53 regulation and hints at a physiological role for Δ160p53 in the context of the ISR. However, abnormal levels of Δ160p53 may contribute to an exacerbated pro-survival p53 target signature, demonstrating the importance of p53 isoform balance.