Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis
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Browsing Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis by advisor "Costa, Luciana Maria Gonçalves da"
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- Expression of iron metabolism: related genes in a portuguese population of Alzheimer’s disease patientsPublication . Cavaco Guerreiro, Cláudia; Rebelo, Maria Teresa; Costa, Luciana Maria Gonçalves da[ENG] Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and one of the most frequent dementia worldwide. The main neuropathological hallmarks of AD are extracellular senile “plaques” (SP) and intracellular neurofibrillary “tangles” (NFT), which are associated with the loss of cortical neurons. This disease is also characterized by elevated brain iron (Fe) levels and accumulation of copper and zinc in cerebral Aβ amyloid deposits, like SP. Thus, a dysfunctional homeostasis of transition metals seems to play pivotal role in pathogenesis of this disease. In this work we intended to further understand the putative role of Fe metabolism in AD pathophysiology. In order to achieve this goal, the expression of specific target Fe metabolism-related genes was measured in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from AD patients and controls by real time quantitative PCR techniques while Fe status in the periphery was evaluated using biochemical standard techniques. The results obtained showed significant decrease in the expression of acotinase 1 (ACO1; P=0.011); ferroportin (SLC40A1; P<0.001); ceruloplasmin (CP; P<0.001); amyloid peptide precursor (APP; P=0.007); transferrin receptor 1 (TFR1; P<0.001) and transferrin receptor 2 (TFR2; P<0.001) genes, in contrast with an increase in the expression of light chain of ferritin (FT-L; P=0.038) in AD patients compared with healthy volunteers. Also, although we did not find significant differences in Fe metabolism parameters measured in serum, a tendency for the decrease in serum Fe and ferritin (Ft) concentrations was observed in AD patients. These observations reinforce previous reports showing a low Fe status in periphery of AD patients. According to these findings one can suggest impairment in cellular Fe efflux in AD individuals, which may lead to cellular Fe overload and oxidative stress, a typical feature of this disease. Nevertheless, further research into the characterization of regulation of Fe metabolism at both phenotypic and genetic levels in AD may be important to provide a low invasive and earlier form for its diagnosis. Resumo: A doença de Alzheimer (AD) é a doença neurodegenerativa mais comum e representa um dos tipos de demência mais frequentes a nível mundial. As suas principais características neuropatológicas são a formação de “placas senis” e de “emaranhados neurofibrilares”, associados à perda de neurónios corticais. Esta doença é também caracterizada pela presença de elevados níveis de ferro (Fe) no cérebro e pela acumulação de cobre e de zinco nos agregados de β-amilóide, que constituem as “placas senis”. Desta forma, uma disfunção na homeostase dos metais de transição parece desempenhar um papel crucial na patogénese da AD. Neste trabalho pretendeu-se compreender o papel do metabolismo do Fe na patofisiologia da AD. A fim de alcançar este objectivo mediu-se expressão de genes-alvo específicos relacionados com o metabolismo do Fe, em células mononucleares de sangue periférico em doentes e controlos, através de técnicas de PCR quantitativo em tempo real. O status de Fe a nível periférico foi avaliado através da utilização de técnicas bioquímicas comuns. Os resultados obtidos mostraram uma diminuição significativa na expressão dos genes acotinase 1 (ACO1; P=0.011); SLC40A1 (P<0.001); ceruloplasmina (CP; P<0.001) proteína percursora da amilóide (APP; P=0.007); receptor da transferrina 1 (RTF1; P<0.001) e do receptor da transferrina 2 (RTF2; P<0.001), enquanto se verificou um aumento da expressão da cadeia leve da FT (FT-L; P=0.038) nos doentes em comparação com os indivíduos saudáveis. Por seu turno, os resultados bioquímicos mostraram, apesar de não terem sido encontradas diferenças significativas entre os doentes e os controlos, uma tendência para uma diminuição da concentração sérica de Fe e ferritina (Ft) e nos doentes. Estas observações estão de acordo com resultados anteriores, que mostraram a existência de uma baixa concentração de Fe periférico em doentes com AD. Os resultados obtidos neste estudo apontam para uma disfunção celular no efluxo de Fe em doentes com AD, o que pode levar a uma sobrecarga de Fe celular e ao stress oxidativo normalmente associado a esta doença. Estudos adicionais sobre a caracterização do metabolismo do Fe periférico tanto a nível fenotípico como genético poderão ser essenciais para o estabelecimento de um diagnóstico mais precoce e menos invasivo para esta doença.
- Iron homeostasis in immune mononuclear cells: a potential role in atherogenesisPublication . Marques, Liliana Alves da Silva; Costa, Luciana Maria Gonçalves da; Canonne-Hergaux, François; Zilhão, Rita Maria Pulido Garcia[PT] A aterosclerose (AT) é uma doença inflamatória caracterizada pela formação de lesões designadas “placas ateroscleróticas” na parede de vasos sanguíneos. A formação destas lesões tem início na disfunção endotelial decorrente da ação de vários fatores de risco e que resulta na acumulação e modificação de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (nomeadamente LDL oxidado (oxLDL)). A acumulação subendotelial de oxLDL promove a ativação das células endoteliais e o consequente recrutamento de células imunitárias, incluindo monócitos e linfócitos do sangue periférico. Os monócitos infiltrados diferenciam-se em macrófagos que, por ingestão de oxLDL, acumulam lípidos no seu interior e se diferenciam nas chamadas “células esponjosas” (do inglês “foam cells”), que são características das placas ateroscleróticas. Vários autores observaram a acumulação de ferro em placas ateroscleróticas, frequentemente associada a “células esponjosas” derivadas de macrófagos. Em 1981, Sullivan propôs a chamada “hipótese do ferro” na qual o nível de ferro armazenado no organismo poderia constituir um fator de risco no desenvolvimento e progressão da AT. De acordo com esta hipótese, a reduzida frequência de desenvolvimento de AT em doentes com hemocromatose hereditária – caracterizados por macrófagos deficientes em ferro apesar da elevada sobrecarga de ferro sistémica – sugere que a retenção de ferro no macrófago promovida pela hepcidina (Hepc) poderá constituir um mecanismo pró-aterogénico crucial na possível associação do ferro à aterogénese. De facto, estudos recentes indicam que a Hepc pode desempenhar um papel pró-aterogénico e que a promoção da saída de ferro mediada pela ferroportina-1 (Fpn1) poderá constituir um mecanismo de resistência do macrófago à diferenciação em “células esponjosas”. Por outro lado, e apesar do seu potencial papel como ferroxidase envolvida na saída de ferro em macrófagos, a ceruloplasmina (Cp) é também capaz de oxidar outros substratos tais como as partículas de LDL. Adicionalmente, visto que a sua expressão é fortemente induzida em condições pró-inflamatórias, a Cp tem sido proposta como um potencial fator pró-aterogénico. Neste contexto, o principal objetivo do presente estudo foi clarificar a regulação da expressão de proteínas envolvidas no metabolismo do ferro nas células imunitárias que infiltram as placas ateroscleróticas, com particular interesse na proteína exportadora de ferro Fpn1 e na Cp como sua potencial parceira neste processo. Numa primeira fase, o objetivo do estudo foi caracterizar a expressão das duas isoformas da Cp em linfócitos, monócitos e macrófagos bem como avaliar o seu potencial envolvimento como ferroxidase na saída de ferro no macrófago mediada pela Fpn1. Os resultados obtidos demostraram que, para além da isoforma solúvel da Cp (sCp) já descrita em outros estudos, os linfócitos, monócitos e macrófagos expressam também uma isoforma membranar desta proteína. A diminuição da expressão da Cp membranar após o tratamento com PIPLC – uma enzima que corta especificamente proteínas com âncoras GPI – demonstrou que pelo menos parte da Cp associada à membrana corresponde à isoforma GPI-Cp nestas células. Adicionalmente, os resultados obtidos pelo nosso grupo de investigação permitiram concluir que a regulação da expressão da Cp em células imunitárias varia de acordo com o tipo de célula, com o seu estado de ativação e inclusivé com o tipo de isoforma. De facto, neste estudo observou-se que condições de stress oxidativo promoveram a diminuição do nível de mRNA de ambas as isoformas da Cp, ao passo que condições pró-inflamatórias induziram o aumento significativo e exclusivo do nível de mRNA da isoforma solúvel (sCp). A expressão da Cp nas células imunitárias que se encontram envolvidas na formação e desenvolvimento das placas ateroscleróticas (monócitos/macrófagos e linfócitos) pode constituir uma fonte de Cp na placa e, consequentemente, um mecanismo adicional para a oxidação de partículas de LDL em condições pró-inflamatórias, o que é corroborado pela co-localização da Cp e oxLDL anteriormente descrita em áreas pró-ateroscleróticas na parede do vaso. Efetivamente, a hipótese da Cp constituir um fator pró-aterogénico é apoiada por vários estudos que observaram uma associação entre o elevado nível de Cp sérica e o risco de desenvolvimento da AT. Contudo, a expressão da Cp em células imunitárias pode estar também associada ao efluxo de ferro nestas células. Estudos recentes demonstraram que após estimulação com ferro, a expressão de Fpn1 em macrófagos aumenta significativamente em macrófagos, sendo recrutada para a membrana plasmática, onde se encontra enriquecida em microdomínios denominados de “jangadas lipídicas” (do inglês “lipid rafts”). Neste estudo, o padrão pontilhado da distribuição da Cp observado à superfície celular de monócitos, macrófagos e hepatócitos imortalizados (HepG2) é indicativo de que esta proteína se encontra concentrada em domínios membranares. Os resultados obtidos confirmaram que parte da Cp expressa em macrófagos bem como em células HepG2 se encontra localizada nas “jangadas lipídicas” e demonstraram ainda uma co-localização parcial entre a GPI-Cp e a Fpn1 em macrófagos estimulados com uma elevada concentração de ferro, o que sugere que a Cp poderá participar como ferroxidase no efluxo de ferro mediado pela Fpn1. Contudo, dado o caráter parcial da co-localização da GPI-Cp e Fpn1, é possível que a sCp ou uma outra ferroxidase possam estar também envolvidas no transporte de ferro pela Fpn1 em macrófagos estimulados com sobrecarga de ferro. Um estudo recente sugere que a proteína precursora do péptido β-amilóide (APP) poderá estar envolvida no efluxo de ferro mediado pela Fpn1 em neurónios, o que é corroborado pela acumulação de ferro nestas células em ratinhos App-/-. Os resultados aqui apresentados confirmaram a expressão da APP em macrófagos e demonstraram que condições de elevada concentração de ferro promovem o aumento da expressão da APP bem como a sua co-localização com a Fpn1 nas “jangadas lipídicas”. Estes resultados estão de acordo com a hipótese de que a APP possa colaborar com a Fpn1 no efluxo de ferro em macrófagos estimulados com sobrecarga de ferro. Deste modo, é proposto um modelo no qual ambas as isoformas da Cp bem como a APP poderão estar envolvidas no efluxo de ferro mediado pela Fpn1 em macrófagos, podendo apresentar papéis sobrepostos mas também complementares. Numa segunda fase, propusemo-nos a clarificar o efeito da presença das partículas de oxLDL na expressão de algumas proteínas-chave no metabolismo do ferro em macrófagos. Os nossos resultados demonstraram que a estimulação de macrófagos com oxLDL levou à polarização do fenótipo Mox descrito por Kadl et al, bem como à acumulação intracelular de lípidos. A análise da expressão génica revelou que a exposição às partículas de oxLDL promoveu o aumento significativo da transcrição da heme oxigenase-1 (HO-1, gene Hmox1) e da Fpn1. Este aumento da transcrição de Hmox1 e Fpn1 não foi observado na presença de partículas de LDL nativo ou acetilado, o que sugere que este efeito é específico da modificação oxidativa das partículas de LDL. Tratamento de macrófagos Nrf2-/- e Nrf2+/+ com oxLDL mostrou que o aumento do nível de mRNA da Hmox1 e da Fpn1 induzido por oxLDL é mediado, pelo menos em parte, pelo fator de transcrição Nrf2. A exposição dos macrófagos a oxLDL conduziu ainda ao aumento significativo da transcrição da Hamp1 (gene da Hepc), interleucina-6 (IL-6, gene Il6) e da cadeia pesada da ferritina (H-Ft, gene Fth1), bem como a diminuição significativa da transcrição de ambas as isoformas da Cp. Contudo, e ao contrário do observado na HO-1, o aumento significativo do nível de mRNA da Fpn1 induzido por oxLDL não foi traduzido num aumento significativo a nível proteico. Este resultado sugere que a síntese da Fpn1 se encontra limitada no fenótipo Mox, provavelmente através de um mecanismo de regulação pós-transcricional influenciado pelo nível intracelular de ferro. Estes resultados sugerem ainda que, apesar da forte indução da transcrição da Fpn1, o efluxo de ferro nos macrófagos Mox se mantém provavelmente residual devido ao nível proteico basal da Fpn1. Contudo, como uma consequência a longo prazo da redução da transcrição da Cp e/ou do aumento da Il6 e Hamp1, é possível que o efluxo de ferro possa estar diminuído nos macrófagos Mox. Por outro lado, a estimulação simultânea de macrófagos com oxLDL (ativador do fenótipo Mox) e com lipopolissacarídeo combinado com interferão-γ (LPS/IFNγ, ativadores do fenótipo M1) induziram a diferenciação de um fenótipo misto entre Mox e M1 (Mox/M1), o que demonstrou que o fenótipo Mox não é predominante sobre o fenótipo M1 nestas condições. Os macrófagos Mox/M1 apresentaram acumulação intracelular de lípidos à semelhança dos macrófagos Mox, sendo caracterizados por um aumento significativo da transcrição da Hmox1, Il6, Fth1 e Cp (especificamente a isoforma sCp) e por uma diminuição significativa da transcrição da Fpn1 à semelhança dos macrófagos M1. Estes resultados sugerem que macrófagos expostos a um ambiente rico em oxLDL e em condições pró-inflamatórias como LPS/IFNγ promovem a acumulação intracelular de lípidos e de ferro em conjunto com o aumento da produção de sCp e de citocinas pró-inflamatórias tais como a IL-6, provavelmente contribuindo para a oxidação das partículas de LDL e para a inflamação local, o que poderá ter um papel pró-aterogénico. De acordo com estudos recentes, é o aumento de expressão de Fpn1 que desencadeia um mecanismo que conduz ao transporte reverso de colesterol e consequente resistência ao desenvolvimento de “células esponjosas”. Deste modo, podemos assumir que a expressão basal (Mox) ou diminuída de Fpn1 (M1, Mox/M1) não confere proteção contra a formação das “células esponjosas”, o que é apoiado pelos resultados de elevada acumulação intracelular de lípidos observada em macrófagos Mox e Mox/M1. Concluindo, os resultados apresentados neste estudo estão de acordo com a “hipótese do ferro” proposta por Sullivan e indicam potenciais mecanismos quer para a acumulação de ferro em macrófagos, quer para a oxidação de LDL, ambos favorecendo a diferenciação de “células esponjosas” nas placas ateroscleróticas, o que contribui para o desenvolvimento e instabilidade das lesões e consequentemente para a progressão da AT.
- The role of peripheral blood mononuclear cells in atherogenesisPublication . Simões Martins Bispo, Cláudia; Crespo, Ana Maria Viegas; Costa, Luciana Maria Gonçalves daAtherosclerosis (ATH) is recognized as a chronic inflammatory condition and it is the leading cause of cardiovascular disease. Atherogenesis is characterized by the infiltration of low density lipoprotein (LDL) through the endothelial layer, and migration of activated peripheral blood lymphocytes (PBL) and monocytes (PBMN) that contribute to a pro-inflammatory state in specific locations. However, the functional interaction between immunity and LDL metabolism is still not fully understood. One hypothesis for the etiopathogeny of ATH may be associated with an ongoing inflammatory process caused by a pro-oxidant/anti-oxidant imbalance induced by metals such as iron (Fe) or copper (Cu). Interestingly, ceruloplasmin (Cp) is a multicopper oxidase with a relevant role in Fe metabolism and oxidation of LDL, but also an acute-phase protein involved in the inflammatory process. Herein, we intended to study by flow cytometry the effect of putative pro-atherogenic immune stimuli on the expression of Cp at the surface of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and search for a putative association with LDL oxidation. Additionally, a population of Familial Hypercholesterolemia (FH) patients was used as a clinical model of ATH to clarify the physiologic interplay between inflammation, Fe/Cu and lipid metabolism at systemic level in this disease. The obtained results showed that higher cell surface expression of Cp was consistently observed in PBMN compared to PBL, in activated vs non-activated cells and in non-T cells vs T cells. Also, PBMC surface expression of Cp was differently modulated by several tested treatments. In particular, various modulators caused opposite effects on Cp expression of PBMN compared to PBL, suggesting a specific cell-type regulation for this protein. Specifically, it was observed that different sources of Fe might activate specific regulation mechanisms of Cp. Until now, due to technical limitations it was not possible to demonstrate an association between PBMC surface Cp expression and oxidation of LDL, but this issue should be addressed in future experiments. Of notice, IL-1β which was found to significantly increase PBMN surface Cp expression in vitro, was increased in serum from FH patients and positively correlated with total cholesterol and ApoB. However, the fact that no correlation was found between IL-1β and serum Cp (sCp)/oxidated LDL suggest that at systemic level, IL-1β may not be a contributing factor for oxidation of LDL by sCp. However, the role of PBMC surface Cp expression on LDL oxidation, namely in specific inflammatory states, remains to be established. In summary, the results of this study demonstrate that specific pro-atherogenic conditions are involved in the modulation of Cp expression at surface of PBMC and thus, suggest a possible a role of Cp in ATH.