DSA - Teses de doutoramento
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Recent Submissions
- Assessing the in vitro toxicity of engineered and airborne nanoceramics: contribution to the safe production and use of nanomaterials in the ceramic industryPublication . Bessa, Maria João; Fraga, Sónia; Teixeira, João Paulo; Laffon, Blanca LageAdvanced ceramic technologies have a strong potential for airborne (nano)particle formation and emission, meaning that workers of those industries are at great risk of exposure to these particles. However, toxicological data of these (nano)particles is lacking, particularly for airborne particles released within sectors such as the ceramic industry. To address this relevant topic, the present work aimed to assess the toxicity of occupationally relevant doses of industrially process-generated particles emitted during two industrial thermal spraying technologies [atmospheric plasma spraying (APS) and high velocity oxy-fuel (HVOF)], as well as of four engineered nanoparticles [ENP; tin oxide (SnO2), antimony-tin oxide (ATO; Sb2O3●SnO2), cerium oxide (CeO2) and zirconium oxide (ZrO2)] used as raw materials for ceramics manufacture. Two human respiratory in vitro systems, either conventional alveolar epithelial A549 cultures under submerged or air-liquid interface (ALI) conditions, or advanced three-dimensional (3D) upper airway epithelium (MucilAirTM) cultures at ALI were exposed to the selected particles. Major toxicity endpoints including plasma membrane integrity, metabolic activity, oxidative stress, inflammatory response, and genotoxicity were assessed. Overall, the tested process-generated particles seem to be more toxic compared to the ENP, most likely due to their higher chemical complexity and composition [elevated levels of metallic elements like chromium (Cr) and nickel (Ni)]. Among the two evaluated thermal spraying processes, particles derived from HVOF were more cytotoxic than those emitted from APS. Either fine (PGFP) and ultrafine (PGNP) particles from both spraying processes were able to induce measurable genotoxic effects. While APS particles lead to increased levels of histone 2AX (H2AX) phosphorylation, HVOF particles caused 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxo-G) oxidative DNA lesions. ENP were more toxic to human alveolar epithelial cultures when aerosolised than in liquid suspension, particularly ZrO2 NP. On the other hand, advanced MucilAirTM cultures, that better mimic in vivo physiological features, such as the mucociliary defence mechanisms, were quite resistant to both HVOF-derived particles and ENP aerosols. Thus, while 3D human upper airway epithelial cultures exhibited attenuated responses, the conventional A549 cultures were more sensitive to the studied (nano)particles.The present work highlights the hazard of industrially derived (nano)particles, either intentionally used or incidentally released into the workplace air during advanced ceramic processes. Importantly, particles’ physicochemical properties alongside the testing conditions (cell model and type of exposure) played a determinant role in the observed biological responses. These findings reinforce the importance of using physiologically relevant in vitro models in (nano)particle toxicity studies, for better data extrapolation to humans.
- Determinants of paediatric asthma: a three-level approachPublication . Paciência, Inês Ribeiro; Moreira, André; Fernandes, Eduardo de Oliveira; Madureira, Joana; Beirão, IdalinaDuring the 20th century, urbanization has increasing and represented a major demographic and environmental change in developed countries. Urban living may offer a greater possibility to better health care, education and social services, but is also associated with increased exposure to air pollution, outdoors and indoors, loss of natural environments and biodiversity and lifestyle changes. Furthermore, this ever-changing urban environment has an impact on diseases patterns and prevalence, namely on noncommunicable diseases, such as asthma and allergy, and poses many challenges to understand the relationship between the changing on the urban environment and the children health. The overall aim of this thesis was to study the role of the environmental determinants of paediatric asthma.
- Efeitos do consumo da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.) na modulação do estresse oxidativo e instabilidade genômica em indivíduos com diabetes mellitus tipo 2Publication . Macan, Tamires; Andrade, Vanessa Moraes de; Teixeira, João Paulo FernandesA diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma doença metabólica cada vez mais prevalente que ocorre, em grande parte, devido às mudanças ambientais e no estilo de vida. Os estados crônicos de hiperglicemia, hiperlipidemia e hiperinsulinemia podem levar ao estresse oxidativo e consequentemente, à oxidação do ácido desoxirribonucleico (DNA). Uma boa prescrição dietética é considerada essencial no tratamento e prevenção de complicações relacionadas à DM2. A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa, H.B.K.) é a melhor fonte alimentar de selênio encontrada na natureza e, níveis adequados deste mineral no organismo apresentam diversos benefícios à saúde, incluindo melhora no estado redox celular e modulação da instabilidade genômica. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do consumo desta oleaginosa sobre parâmetros bioquímicos, de estresse oxidativo e instabilidade genômica em indivíduos com DM2. Participaram deste estudo 37 homens e 37 mulheres, que consumiram 1 castanha-do-Brasil por dia (»210 μg de selênio) durante 6 meses. Foram coletadas amostras de sangue periférico e células esfoliadas da mucosa bucal imediatamente antes do início e ao final do estudo. Foram analisados os perfis glicêmico, lipídico, inflamatório, hepático e renal, além dos níveis séricos de selênio. Em relação ao estresse oxidativo, foram determinados os níveis de 2',7'-diclorofluoresceína (DCF), nitritos, tióis totais, grupamentos carbonila, malondialdeído (MDA), glutationa (GSH), glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT). O ensaio cometa nas versões alcalina e modificada com o uso de formamidopirimidina glicosilase foi utilizado para análise dos danos basal e oxidativo ao DNA, respectivamente. O teste de micronúcleo em células esfoliadas da mucosa bucal foi utilizado para caracterização dos tipos celulares, anormalidades nucleares e presença de dano nuclear. As análises estatísticas foram feitas usando os testes t pareado ou de Wilcoxon e, correlação Spearman. Ao analisar os parâmetros bioquímicos, foram observados aumento dos níveis de glicemia de jejum, colesterol HDL e LDL e gama-glutamiltransferase. Os níveis de insulina e a relação triglicerídeos/HDL-colesterol foram diminuídos. O consumo de castanha-do-Brasil durante seis meses foi capaz de aumentar significativamente os níveis de selênio, GSH, GPx e CAT, sugerindo uma melhora do sistema antioxidante dos pacientes. Em relação à produção de oxidantes, os níveis de DCF e nitritos foram diminuídos. Observou-se um aumento dos níveis de tióis totais e diminuição do conteúdo de grupamentos carbonila e níveis de MDA, sugerindo uma redução na oxidação de proteínas e lipídios. Quanto à instabilidade genômica, os 16 danos ao DNA, avaliados através do ensaio cometa foram significativamente diminuídos, assim como a frequência de micronúcleos e brotos nucleares também. Os testes estatísticos revelaram que os níveis de selênio foram negativamente associados aos níveis de MDA, danos ao DNA e frequência de micronúcleos. Por outro lado, houve uma associação positiva entre os níveis de selênio e tióis totais, GSH, GPx e CAT. Os resultados do presente trabalho sugerem que a ingestão diária de castanha-do-Brasil pode ser uma aliada na modulação da instabilidade genômica em indivíduos com DM2, provavelmente através de mudanças no estado redox celular.
- Molecular and biological determinants associated with Mycobacterium tuberculosis strains prevalent in PortugalPublication . Silva, Carla; Portugal, Isabel; Jordao, LuisaMultidrug (MDR) and extensively drug resistant (XDR) tuberculosis (TB) cases constitute a serious health problem in Portugal due to the existence of two unusual phylogenetic clades, Lisboa3 and Q1 clades, identified in Lisbon Health Region in the1990’s. The high prevalence of these strains over the years, suggest the existence of molecular and biological determinants underlying adaptation and persistence in the Portuguese settings. In this research work we first sought to investigate the molecular basis of resistant TB, as well as to determine the prevalence of specific drug resistance mutations and its association with M/XDRITB. SeventyIfour M. tuberculosis clinical isolates collected in Lisbon Health Region were genotyped by 24&loci MIRUIVNTR, and the mutational profile associated with firstI and second line drug resistance was studied. Seven new mutations were found, while the remaining mutations (n=28) were previously associated with drug resistance. None of which was specifically associated with MDR-TB. We also establish that the 15 loci MIRU-VNTR was the most adequate genotyping technique, showing an adequate discriminatory power,comparable to the 24 loci set, allowing the clustering of 60% and 86% of the MDR and XDR-TB isolates, respectively, the majority of which belonging to the Lisboa3 and Q1 clusters. From an epidemiological standpoint, this study suggests that a combined mutational and genotyping analysis is a valuable tool for molecular epidemiological surveillance of drug resistance strains. Then, we analysed the morphological and structural features of the Lisboa family and Q1 cluster isolates by scanning and transmission electron microscopy techniques. These analyses allowed the identification of structural differences, namely the reduced cell length in Lisboa family strains, and a thickened cell envelope observed in drug resistant M. tuberculosis clinical isolates. Moreover, the infection of human monocyte derived macrophages allowed us todocument the relative selective advantage of the Lisboa family isolates over other circulating M. tuberculosis isolates, translated in a higher growth rate in vivo. Given the observations of the multiple advantages of the coccoid morphology regarding adaptation to different environmental stresses, and the contribute of the reduced cell size in the interactions between bacteria and the surrounding environment and the influence in complement evasion strategy as well, led us to hypothesized that the reduced size observed might confer a selective advantage, which could be the result of an adaptation process to the host or an advantage mechanism for host persistence and dissemination. Next, to enable the rapid characterization of Mycobacterium metabolism upon adaptation to adverse environmental conditions, we described a simple and rapid method to evaluate the metabolic rate of M. tuberculosis strains, based on the resazurin reduction kinetics. To optimize this technique, two parameters were analysed: mycobacterial concentration and time-point measure of resazurin reduction. We evaluate different bacterial concentration under standard (pH6.7), and different environmental conditions (pH4.5, pH5.5 and anaerobiosis), and the absorbances corresponding to the reduced and oxidized form of resazurin were measured at the following time-points: 0h, 6h, 24h and 48h. Three independent replicas of the entire procedure were performed. The method revealed to be reproducible with low standard deviations. The data generated showed that the 1x108 CFU/ml was the best bacterial suspension for this assay,considering measurements at the following time points: 0h, 6h and 24h. This methodology enables precise determination of mycobacterial metabolic activity in a given environmental condition, at several time points of incubation. Such precision allows comparison of the metabolic activity of Mycobacterium strains, from different genotypes or phenotypes. Subsequently, this methodology was used to analyse and compare the metabolic activity of 13 M. tuberculosis strains in response to low pH and anaerobiosis, which are known to trigger metabolic shift towards low metabolic states and non replicative persistance. Overall, isolates from Lisboa3 and Q1 clade showed low metabolic activity under pH5.5, pH4.5; Lisboa3 isolates presented lower metabolic rate under anaerobic conditions. No association was found between drug resistance and the metabolic rate of M. tuberculosis isolates. Overall, comparing metabolic activity, Lisboa3 isolates presented a very homogenous metabolic pattern, whereas isolates from other family or clade showed no similar metabolic patterns. This study provides important clues for the potential adaptation of M. tuberculosis strains from distinct phylogenetic clades, suggesting that the distinct metabolic profile found may underlie a more effective response under harsh conditions, such as the ones found during the in vivo infection. The data herein generated, provides insights into the morphological and biological features of M. tuberculosis Lisboa3 and Q1 isolates, highlighting specific characteristicts that might contribute to Lisboa strains prevalence in the Portuguese settings through selectively advantageous phenotypic traits.
- The influence of indoor environment in respiratory health and quality of life of older people living in elderly care centersPublication . Mendes, Ana Sofia; Teixeira, João Paulo; Porto, BeatrizThe mean age of the European population is rising and percentage of adults aged 65 years and older is projected to increase from 16% in 2000 to 20% in 2020. It has been estimated that older subjects spend approximately 19 to 20 h/day indoors. Older individuals may be particularly at risk for detrimental effects from pollutants, even at low concentrations, due to reduced immunological defenses and multiple underlying chronic diseases. This cross-sectional study explored environmental variables and buildings characteristics in 22 elderly care centers (ECC) out of a total of 58 institutions in Porto, Portugal.
- Avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas (cianotoxinas)Publication . Dias, Elsa; Batoréu, Maria Camila Canteiro; Jordan, Peter; Silva, Maria JoãoAs microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- -iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas.
- Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural watersPublication . Churro, Catarina; Vasconcelos, Vitor Manuel de OliveiraThe most common cyanotoxins in Portuguese freshwaters are microcystins and their occurrence has been mainly attributed to cyanobacteria from the Microcystis genus. However, most recently, it has been described the production of these toxins by species of the Planktothrix, suggesting that this genus is also a major producer of microcystin in Portuguese surface waters. Nevertheless, and conversely to the Microcystis species, the knowledge on the occurrence, distribution and toxigenesis of Planktothrix is still limited. Planktothrix species exhibits some particularities that difficult their sampling, identification, quantification and toxigenic characterization in natural samples - Chapter 2. Particularly, the morphology of Planktothrix colonies does not allow distinguishing easily the individual cells. This makes their identification and quantification by optical microscopy a very difficult task, although this is the method generally used in cyanobacteria monitoring. Moreover, the most common methods for the detection of microcystins (ELISA, HPLC) do not identify the producer strains. These strains can be identified by conventional PCR, but this method doesnt enable to quantify them. In resume, there is not yet available a method that allow simultaneously identify and quantify microcystin-producing strains. This work aimed to develop a method based on Real-Time PCR applied to the monitoring of toxic species of Planktothrix in surface freshwater reservoirs used as drinking water supply and for recreational activities. The experimental work was developed according to several phases that are listed and explained below. In a first approach, field surveys were conducted to access the occurrence and distribution of Planktothrix – Chapter 3. It was observed that Planktothrix has a wide distribution in Portuguese lakes and that Planktothrix agardhii is the most commonly found specie. Furthermore microcystin production was detected in isolates from this species. In a second stage, it was developed a method based on real-time PCR to detect and quantify Planktothrix agardhii - Chapter 4. The real-time PCR is a promising technique for cyanobacteria research and monitoring. The main advantage of real-time PCR over conventional PCR is the ability to quantify the target gene copy numbers on a sample. Thus, in addition to identifying Planktothrix strains, the real-time PCR also enables to quantify those strains, which constitutes an advantage over the procedures used in the routine monitoring of cyanobacteria. It should be noted that the determination of the cell FCUP Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters vii density is critical in the risk assessment of toxic cyanobacteria, as the guideline values for cyanotoxins are based on cyanobacterial concentrations as well as on toxin cell quota. Another important aspect in cyanobacteria monitoring is the use of preserved samples. Preservation is used to maintain the morphologic features of cyanobacterial cells to further be used in their identification/quantification and also to avoid sample degradation during transport. In this work, the applicability of the real-time technique in the amplification of DNA from preserved samples was evaluated, by using the method previously developed for cell quantification – Chapter 5. The results indicate that real-time PCR is a robust technique applicable to those types of samples but that the most common preservation methods (Lugol’s solution, formaldehyde, glutaraldehyde) reduce the DNA quantity and quality. Since DNA degrades fast in those samples, the applicability of real-time PCR on preserved samples was tested using other preservation procedure – Chapter 6. The preservation in methanol 100% at -20ºC allowed maintaining the integrity of the samples both for morphologic and molecular analysis up to two years after preservation. The last chapter of this thesis reports the result of two years of monitoring of a reservoir having a persistent bloom of toxic P. agardhii (Appendix A) - Chapter 7. In this reservoir, high cell densities did not always correspond to high amounts of toxin and vice versa. Using the real-time PCR it was demonstrated that both toxic and non-toxic strains are present within the reservoirs and that they can flourish at different times. It was also detected a specie from another genus that also contributes to the production of microcystins. During the monitoring it was observed a chytrid parasite that infected the filaments of Planktothrix (Appendix A). The density of this parasite was also quantified by real-time PCR and the results showed that its development coincides with the increase of toxic Planktotrhix strains and of microcystin levels in the reservoir.
- Avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas (cianotoxinas)Publication . Dias, Elsa; Batoréu, Maria Camila Canteiro; Jordan, Peter; Silva, Maria JoãoAs microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- - iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8- trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica ii não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de iii micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH iv recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas.