Vicente, Astrid MouraDias, Deodália Maria AntunesLopes, Ana Leonie Correia Barreto2019-03-062021-10-282018-11http://hdl.handle.net/10400.18/6061Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Departamento de Biologia Animal, 2018.Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis, Unidade de Investigação e Desenvolvimento, Grupo de Neurogenética e Saúde Mental do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP (novembro de 2017 a setembro de 2018)Defendida e aprovada em 9 de novembro de 2018Autism Spectrum Disorder (ASD) is a pervasive and clinically heterogeneous neurodevelopmental disorder by deficits in social communication and interactions skills, and repetitive and stereotyped behaviours. It has becomes apparent that ASD has a strong genetics component. However, the level of heritability is still debated: compared to older and smaller studies, results from recent studies estimate a lower heritability percentage (83%), thus leaving a meaningful percentage of the risk that could be explained by environmental factors. Exposure to potentially harmful environmental factors can result in neurodevelopmental issues, due to neurotoxicity. Such environmental factors include endocrine disruptive chemicals like BPA, PBDEs, phthalates, PAHs, pesticides, and heavy metals, which disrupts optimal hormonal function, as well as pharmaceutical drugs which are able to cross physiological barriers and come into contact with the fetus. Moreover, the incorrect metabolization of these xenobiotics due to defective enzymatic activity may be linked to an increased risk of ASD. It has been suggested that individuals carrying polymorphisms that hinder the activity of cytochrome p450 enzymes, responsible for phase I metabolism, as well as UDP-glucuronosyltransferases and glutathione S-transferase enzymes responsible for phase II metabolism, will be more susceptible to potentially toxic chemicals. Therefore, considering the role played by environmental factors, this pilot study aims to investigate and contribute to the understanding of gene-environment interactions in ASD. In order to do this, we explored the usage of the Early Life Exposure Assessment Tool (ELEAT): a questionnaire which indirectly examines child’s exposure to exogenous factors that could be related to ASD from 3 months before conception, during pregnancy, to the first year of the child’s life, by analyzing maternal exposure. We aimed to investigate the type of data that could be obtained from this questionnaire, how it could be treated, and ultimately how it could be related to genetic information obtained from probands. The questionnaire was filled by 20 Portuguese mothers who had been part of a previous study. Additionally, we were able to obtain 14 biological samples from the children whose mothers filled out the questionnaire, who were then screened for various functional polymorphisms in genes known to interact with the environmental factors investigated in ELEAT. Finally, we related probands’ genotype to exposure reported in the ELEAT. Our results suggest that mothers were indeed exposed to some of the environmental factors being studied by the ELEAT in these critical periods of neurodevelopment. Additionally, genotyping results showed that this group of probands did carry a number of the polymorphisms being investigated in this pilot study, which could make them more susceptible to certain xenobiotics. When we merged probands’ genotype to reported exposure, we concluded that probands may have been exposed to the chemicals they were sensitive to during neurodevelopment. Most of the variants investigated in this study have not been yet related to ASD, but have the potential to indirectly contribute to the disorder’s onset. Our results demonstrate that meaningful results can be obtained from combining the ELEAT with genetic information. Seeing as the general population is somewhat regularly exposed to some levels of these chemicals, genetic factors play a crucial role in increasing susceptibility and thus leading to negative consequences such as increased ASD risk. This pilot study is an important step for future studies that intend to use the ELEAT to identify environmental risk factors for ASD. These should include a large population sample, and an equal number of controls, in order to obtain statistical power when calculating the multiplicative effect of given environmental exposures with genetic liability. In conclusion, the ELEAT could play a vital role in the understanding of geneenvironment interactions, and the development of preventive strategies for autism.Introdução: A Perturbação do Espectro do Autismo (PEA) é uma perturbação do neurodesenvolvimento clinicamente heterogénea caracterizada por défices na capacidade de comunicação e interação social, interesses repetitivos e comportamentos estereotipados. A PEA inclui indivíduos que possuem desde baixo até alto funcionamento e pode apresentar-se acompanhada de um vasto número de co-morbilidades, como a Síndrome do X Frágil, epilepsia e problemas gastrointestinais, que contribuem para a sua heterogeneidade fenotípica. A PEA tem uma forte componente genética, com estudos recentes a estimarem uma heritabilidade na ordem dos 83%. Estes valores sugerem também, que uma parte do risco seja explicada por causas não-genéticas, nomeadamente a presença de concentrações séricas baixas de certos factores nutricionais como a vitamina D e o ácido fólico já foram relacionados com o aumento do risco de desenvolver a perturbação. Também a exposição a tóxicos ambientais, potencialmente prejudiciais e neurotóxicos, pode resultar em problemas no neurodesenvolvimento, Estes incluem: disruptores endócrinos como o bisfenol A (BPA), éteres de difenila polibromados (PBDEs), ftalatos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), pesticidas e metais pesados (nomeadamente chumbo e mercúrio), que interferem com o funcionamento hormonal normal, bem como medicamentos capazes de atravessar as barreiras fisiológicas (hematoencefálica e placentária) e interferir com o feto. Estudos recentes suportam, com diferentes níveis de evidência, a associação entre a exposição a xenobióticos e o risco de desenvolver PEA. Tem sido sugerido que indivíduos portadores de polimorfismos que alteram a atividade das enzimas do citocromo p450, responsáveis pelo metabolismo de fase I, bem como as enzimas UDP-glucuronosiltransferases e glutationa S-transferases, responsáveis pelo metabolismo de fase II, serão mais suscetíveis a substâncias químicas potencialmente tóxicas. Normalmente, os estudos na PEA tendem a focar-se somente em factores genéticos ou em fatores não-genéticos, havendo uma necessidade urgente de desenvolver abordagens que integrem conjuntamente as duas componentes. Objetivo: Considerando que alguns casos de PEA poderão resultar da combinação entre a susceptibilidade genética individual e a exposição a fatores ambientais durante o neurodesenvolvimento, com este estudo piloto pretende-se investigar e contribuir para um melhor conhecimento das interações gene-ambiente na etiologia da PEA. Métodos: Foi explorada a aplicação do instrumento de investigação denominado: Estudo Longitudinal da Exposição Ambiental a Toxinas (ELEAT) - um questionário detalhado que examina indiretamente a exposição das crianças a fatores exógenos que podem estar relacionados com a PEA, desde os 3 meses antes da conceção, no decurso da gestação e estendendo-se ao longo do primeiro ano de vida. Nesta fase pretendemos investigar que tipo de dados podem ser obtidos a partir deste questionário, o modo como os dados podem ser tratados e, finalmente, como podem ser relacionados com a informação genética subsequentemente obtida de probandos. Responderam ao questionário 20 mães portuguesas com pelo menos um filho com PEA, recrutadas através de um estudo anterior. Na avaliação da componente genética do estudo, 14 amostras de DNA de crianças com PEA (cujas mães preencheram o questionário) foram testadas para a presença de vários polimorfismos funcionais em 14 genes: ABCB1, ACHE, AHR, CYP2D6, CYP2C19, CYP3A4, GSTM1, MTHFR, PLCG1, PON1, TNFRSF11B, UGT1A, UGT2B15, VDR. Este conjunto de genes foi selecionado pela sua relação com os fatores ambientais investigados no ELEAT, e os polimorfismos investigados têm potencial de influenciar a forma como os indivíduos portadores respondem à exposição a esses fatores. Finalmente, relacionámos o genótipo dos probandos com a exposição a xenobióticos reportada no referido questionário. Resultados: Os resultados obtidos do ELEAT sugerem que as mães e respetivos filhos(as) foram expostos a alguns dos fatores ambientais estudados, durante períodos críticos para o neurodesenvolvimento. Os resultados da genotipagem mostraram que o grupo de probandos é portador de variantes em vários dos genes investigados neste estudo, o que poderá torná-los mais suscetíveis a certos xenobióticos. Foram identificados portadores de alelos de menor frequência em genes como o ABCB1, ACHE, AHR, CYP2R1, CYP2C19, CYP3A4, PON1, UGT2B15 e VDR. Foram também encontrados indivíduos homozigóticos para o alelo alternativo em polimorfismos dos genes ACHE, AHR, PON1 e UGT2B15. Estes genes são particularmente importantes na resposta à exposição a pesticidas, PAHs e BPA, o que poderá ter um impacto na forma como os seus portadores respondem a tais exposições. Indivíduos com estes genótipos poderão exibir um maior risco de desenvolvimento de problemas no neurodesenvolvimento, como a PEA. Quando cruzamos o genótipo dos probandos com a exposição reportada, verificamos que os probandos portadores de alguns dos polimorfismos podem ter sido expostos aos produtos químicos aos quais são sensíveis durante períodos críticos do desenvolvimento neurológico. Discussão: Os nossos resultados demonstram que se podem obter dados importantes da combinação do ELEAT com informação genética. Apesar de extenso, o questionário relevou-se uma ferramenta útil para a recolha de informação relativa à exposição ambiental. A genotipagem de vários polimorfismos comuns na população geral, mas que poderão afetar a metabolização de vários fatores ambientais, poderá constituir uma abordagem apropriada para a identificação de indivíduos em maior risco de desenvolver PEA. Uma vez que a população geral está regularmente exposta a alguns dos produtos químicos analisados, os factores genéticos desempenham um papel crucial no aumento da suscetibilidade e, portanto, podem levar a consequências negativas, como o aumento do risco a PEA. Algumas variantes investigadas neste estudo ainda não foram relacionadas com a PEA, mas têm o potencial de contribuir indiretamente para o desenvolvimento da patologia. Este estudo piloto é um passo importante para futuros trabalhos de investigação que pretendam usar o ELEAT para identificar fatores de risco ambientais para a PEA. Tais estudos deverão incluir uma amostra populacional grande e igual número de controlos, a fim de obter poder valor estatístico para calcular o efeito combinado de exposições ambientais e suscetibilidade genética. Conclusão: Apesar da sua limitada dimensão, o estudo aqui apresentado é de particular relevância pois é um ponto de partida para o estudo conjunto de fatores genéticos e não-genéticos na PEA. Dado que o contacto com fatores ambientais poderá ser modificado de forma a evitar a exposição por indivíduos particularmente suscetíveis, o estudo de fatores de risco ambientais é de extrema importância. Em conclusão, a integração de informação recolhida através do ELEAT com informação genética poderá contribuir para a compreensão das interações gene-ambiente e para o desenvolvimento de estratégias preventivas para a Perturbação do Espetro do Autismo.engAutism Spectrum DisorderAutismEnvironmentGeneticsMetabolismDetoxificationAutismoAmbienteGenéticaMetabolismoPerturbações do Desenvolvimento Infantil e Saúde Mentalmaster thesis