Alves, Ana CatarinaRebelo, Maria TeresaFerreira, Maria Rafael Simões do Carmo2024-03-112023-04-26http://hdl.handle.net/10400.18/9166Alves, Ana Catarina Rebelo, Maria TeresaDissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de ciências da Universidade de Lisboa, 2023.Data do grau: 26-04-2023.Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal semi dominant disorder of lipid metabolism clinically characterized by increased levels of circulating LDL cholesterol and associated with elevated cardiovascular risk. The genetic diagnosis is usually based on the analysis of LDLR, APOB, and PCSK9 genes. APOB variants are responsible for 5-10% of FH cases, and the variant spectrum of APOB has increased due to sequencing of the whole gene through Next Generation Sequencing, consequently increasing the number of variants that need to be functionally assessed. This dissertation aimed to verify the correlation between phenotype and genotype in individuals from the Portuguese FH Study, as well as create a database including all APOB variants found up to date in this study. Moreover, it was intended to characterize two APOB variants identified in subjects from this cohort. Graphics regarding LDL cholesterol levels were designed for index cases FH positive and negative and relatives FH positive. The variants previously detected by NGS were confirmed by PCR and Sanger sequencing, and cascade screening was carried out in families. All APOB variants with MAF <1% were gathered into a database. LDL from index cases and relatives was separated using sequential ultracentrifugation and labelled with FITC for uptake assessment by flow cytometry in CHO-ldlA7 cells, and proliferation assays were performed with U937 cells. A definite diagnosis was possible for 4 individuals carrying known pathogenic variants, and c.6639_6641del/p.(Asp2213del) and c.10121T>C/p.(Ile3374Thr) alterations from exon 26 were functionally assessed. In vitro studies showed a neutral effect on the apoB function for these variants. Furthermore, 143 different variants were discovered located throughout the whole gene, of which more than 90% were variants of uncertain significance. Functional studies, combined with the association between phenotype and genotype, allow a better and more personalized treatment according to the needs of each individual.A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma condição genética do metabolismo lipídico transmitida de forma autossómica semi dominante. Clinicamente caracteriza-se por níveis elevados de colesterol LDL no plasma e encontra-se associada ao desenvolvimento de doença cardiovascular precoce. A forma homozigótica da FH é rara e mais severa, ao contrário da forma heterozigótica que tem uma prevalência estimada de 1/300 indivíduos na maioria das populações. Apesar da sua frequência, a FH encontra-se subdiagnosticada e subtratada a nível global. A FH resulta maioritariamente de variantes no gene que codifica o recetor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLR), com mais de 3000 variantes identificadas neste gene. No entanto, embora menos frequente, pode derivar também de variantes nos genes da apolipoproteína B-100 (APOB) ou proproteína convertase subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9). A apoB é uma glicoproteína existente na estrutura das partículas de LDL responsável pela ligação do LDL ao LDLR, permitindo a internalização destas partículas de colesterol. Variantes no gene APOB podem levar a alterações na função correta da proteína e afetar a sua correta ligação ao recetor das LDL, provocando um aumento dos níveis de colesterol. O gene APOB está associado a 5-10% dos casos de FH, sendo que o número de variantes identificadas neste gene tem vindo a aumentar devido ao aperfeiçoamento das técnicas de Sequenciação de Nova Geração (Next Generation Sequencing, NGS) nos últimos anos. Apesar de muitas variantes serem reportadas, para a maioria existe pouca informação, incluindo a falta de estudos funcionais que comprovem a sua patogenicidade, pelo que é importante caracterizar funcionalmente as novas variantes para compreender em que medida afetam a função da proteína. O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF), implementado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge em 1999, visa a deteção e caracterização precoce de FH através da identificação da causa genética associada. A população em estudo inclui indivíduos de todas as idades que apresentem diagnóstico clínico de FH segundo os critérios de Simon Broome. O EPHF inclui a realização de estudos funcionais para avaliar o efeito das variantes cuja patogenicidade é ainda desconhecida, contribuindo para uma terapêutica personalizada. Este trabalho teve como objetivo avaliar a importância do diagnóstico genético nos indivíduos com diagnóstico clínico de FH. Para além disso, pretendeu-se criar uma base de dados incluindo todas as variantes encontradas até ao momento no gene APOB, bem como estudar funcionalmente duas variantes detetadas neste gene, de modo a averiguar a sua patogenicidade. Primeiramente, a partir dos dados bioquímicos antes de tratamento dos indivíduos incluídos no EPFH, foram projetados os valores de colesterol LDL para casos índex e respetivos familiares com diagnóstico positivo e negativo de FH, tanto para os homens como para as mulheres. Foram também projetados os valores de LDL no caso de diagnóstico positivo devido a variantes comuns nos genes LDLR e APOB, e para os indivíduos que apresentam variantes no gene APOB. O estudo molecular de fragmentos do gene APOB foi realizado por Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciação de Sanger para confirmar as variantes encontradas previamente por NGS nos casos índex. Quando disponíveis amostras dos familiares, foi realizada a co-segregação da variante encontrada na respetiva família. Todas as variantes já encontradas no EPHF com uma frequência alélica inferior a 1% no gnomAD foram reunidas numa base de dados. Foi recolhida o máximo de informação sobre cada variante, incluindo se estavam descritas e a descrição dos estudos funcionais realizados, quando disponível, utilizando os repositórios ClinVar e PubMed. O painel controlo de normolipidémicos foi consultado para verificar a frequência de casa alteração incluída. As variantes foram classificadas de acordo com os critérios ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics), seguindo adaptações específicas para a FH. Posteriormente, duas variantes encontradas foram estudadas funcionalmente para avaliar potenciais defeitos na ligação das partículas de LDL ao LDLR através da molécula apoB. Para isso, LDL dos casos índex e respetivos familiares, bem como de um indivíduo sem alterações e de um indivíduo com a variante p.(Arg3527Gln) (controlo positivo), foi isolado por ultracentrifugação sequencial com gradiente de densidade. Células CHO-ldlA7, que não expressam o endogenamente o recetor, foram transfetadas com plasmídeos wildtype e a internalização de LDL foi avaliada através de ensaios de citometria de fluxo com a utilização de LDL fluorescente marcado com FITC. Células U937, que são dependentes da ligação apoB:LDLR para a obtenção de colesterol para proliferar, foram utilizadas para realizar ensaios de proliferação. O fenótipo de FH dos indivíduos não permite identificar por si quais os que poderão ter uma variante causadora de doença dos que não apresentam, pelo que o diagnóstico genético é crucial para a identificação da causa de doença e correto tratamento. Nesta dissertação foram identificadas 30 variantes diferentes no gene APOB em 34 casos índex, embora uma seja benigna. Para 4 indivíduos foi possível um diagnóstico definitivo de hipercolesterolemia, uma vez que apresentavam variantes classificadas como patogénicas. Destes, três apresentavam a variante mais comum deste gene descrita como patogénica: c.10580G>A/p.(Arg3527Gln). Apenas quatro das variantes encontradas já apresentavam estudos funcionais, e 5 variantes estão também presentes no painel de normolipidémicos. Através do estudo em cascata de familiares foi possível encontrar a mesma variante em 20 dos familiares. Desde o início do EPHF, 143 variantes com uma frequência alélica inferior a 1% foram encontradas ao longo de todo o gene APOB, sendo que 56% destas estão localizadas nos exões 26 e 29. As variantes são maioritariamente missense, apenas tendo sido identificadas duas deleções in frame (uma no exão 26 e outra no exão 29), uma frameshift e uma nonsense que causam um codão stop prematuro (ambas no exão 29). Destas alterações, 41 foram descritas pela primeira vez em Portugal e 31 não se encontravam ainda reportadas em bases de dados públicas. Para além disso, 44 variantes foram detetadas num painel de indivíduos normolipidémicos portugueses. Apenas 9 variantes tinham estudos funcionais, a maioria tendo sido realizados pelo Grupo de Investigação Cardiovascular do INSA. Segundo as recomendações ACMG, 4 variantes foram classificadas com patogénicas, 2 como provavelmente patogénicas, 1 como provavelmente benigna e 2 como benignas; as restantes foram classificadas como variantes de significado incerto (VUS). Verificou-se um grande número de VUS, estando associado a lacunas de informação tanto clínica como populacional, sendo a falta de estudos funcionais um dos motivos. No futuro pretende-se expandir esta base de dados com variantes encontradas a nível global. A análise in vitro das variantes c.6639_6641del/p.(Asp2213del) e c.10121T>C/p.(Ile3374Thr), ambas do exão 26, revelou que ambas apresentam um resultado semelhante ao wildtype em ambos os ensaios realizados, pelo que estas alterações parecem não afetar a função normal da proteína apoB. Além disso, a variante c.6639_6641del/p.(Asp2213del) foi encontrada em dois indivíduos do painel de normolipidémicos. A classificação destas variantes passou a provavelmente benigna após os novos dados obtidos com a caracterização funcional. Apenas foi possível realizar estudos funcionais para duas variantes uma vez que é necessária uma segunda colheita de sangue para a obtenção do soro para o isolamento das lipoproteínas, sendo uma grande limitação para a realização destes ensaios. A FH encontra-se associada a um elevado risco cardiovascular, pelo que o seu diagnóstico precoce é de extrema importância. A partilha de dados, nomeadamente através de bases de dados atualizadas, é fundamental para um melhor conhecimento da doença, ajudando o diagnóstico genético e a correta classificação das variantes. No entanto, a falta de estudos funcionais para a maioria das variantes pode comprometer o diagnóstico da FH, uma vez que é um dos critérios mais importantes para as classificar como patogénicas. A caracterização funcional de variantes associadas aos genes da FH permite entender o efeito das variantes na função das proteínas e a consequência para o ciclo celular do LDLR. A combinação fenótipo-genótipo-caracterização funcional contribui para a obtenção de um diagnóstico definitivo e para o desenvolvimento de uma terapêutica dirigida e personalizada para cada indivíduoengFamilial HypercholesterolaemiaAPOBMolecular DiagnosisFunctional StudiesHipercolesterolemia FamiliarDiagnóstico MolecularEstudos FuncionaisDoenças Cardio e Cérebro-vascularesPortugalmaster thesis203486501