Bourbon, MafaldaAlves, Ana CatarinaRamos, Diana Catarina Fernandes2025-11-182025-11-182025-05-212025http://hdl.handle.net/10400.18/10615Dissertação de mestrado em Bioquímica e Biomedicina, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2025Orientadora Mafalda Bourbon e coorientadora Ana Catarina Alves (Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis, INSA)A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma doença caracterizada por níveis elevados de colesterol LDL, que se acumulam nas artérias, promovendo o desenvolvimento precoce de eventos cardiovasculares. Geneticamente, a FH é transmitida de forma autossómica semi-dominante, sendo causada por variantes nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As variantes no gene APOB afetam a ligação do colesterol LDL ao seu recetor, representando 5 a 10% dos casos de FH. No entanto, para a maioria das variantes identificadas, o efeito funcional na proteína ainda não está determinado. Esta dissertação teve como objetivo principal investigar a correlação entre fenótipo e genótipo, além de caracterizar funcionalmente variantes identificadas no gene APOB em indivíduos com diagnóstico clínico de FH na população portuguesa. Como objetivo secundário, foi desenvolvida uma base de dados que reúne todas as variantes deste gene com estudos funcionais realizados até ao momento. A identificação das variantes foi realizada por sequenciação de nova geração (NGS) e confirmada por PCR e sequenciação de Sanger, seguida da pesquisa da variante nos familiares dos casos index. As variantes em estudo foram identificadas no âmbito do projeto EPHF. O LDL dos participantes foi isolado por ultracentrifugação a partir do soro de casos index e familiares com variantes no gene APOB, bem como de indivíduos normolipidémicos. Este LDL foi marcado com fluorescência e incubado em células CHO-ldlΔ7 para avaliar a capacidade de ligação e internalização do LDL. A caracterização funcional, realizada por citometria de fluxo com LDL fluorescente, revelou que as variantes p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu) e p.(Arg4519Thr) apresentavam ligação e internalização normais do LDL, indicando que estas variantes não comprometem a função da proteína. Este trabalho destaca a importância de caracterizar funcionalmente as variantes no gene APOB para melhorar o diagnóstico dos indivíduos com FH, possibilitando tratamentos mais adequados a cada caso e contribuindo para a redução do risco cardiovascular.Familial hypercholesterolemia (FH) is a disease characterized by elevated LDL cholesterol levels, which accumulate in the arteries, leading to the early onset of cardiovascular events. Genetically, FH is caused by variants in the LDLR, APOB, and PCSK9 genes, presenting a semi-dominant autosomal transmission pattern. Variants in the APOB gene affects the binding of LDL cholesterol to its receptor, accounting for 5 to 10% of FH cases. However, for most identified variants, the functional effect on the protein remains undetermined. The primary aim of this dissertation was to investigate the correlation between phenotype and genotype and to functionally characterize variants identified in the APOB gene in individuals with a clinical diagnosis of FH in the Portuguese population. A secondary objective was to develop a database that compiles all known variants of this gene with functional studies conducted to date. The identification of variants was performed using next-generation sequencing (NGS) and confirmed by PCR and Sanger sequencing, followed by screening the variants in the relatives of the index cases. The variants studied were identified as part of the EPHF project. The LDL of the participants was isolated by ultracentrifugation from the serum of index cases and relatives with variants in the APOB gene, as well as from normolipidemic individuals. This LDL was fluorescently labeled and incubated in CHO-ldlΔ7 cells to assess LDL binding and internalization capacity. Functional characterization, performed using flow cytometry with fluorescently labeled LDL, revealed that the variants p.(Asp1456Asn), p.(Val4295Leu), and p.(Arg4519Thr) exhibited normal LDL binding and internalization, indicating that these variants do not impair protein function. This study highlights the importance of functionally characterizing variants in the APOB gene to improve the diagnosis of individuals with FH, enabling more appropriate treatments for each case and contributing to the reduction of cardiovascular risk.porHipercolesterolemia FamiliarAPOBVariantes GenéticasEstudos FuncionaisDoenças Cardio e Cérebro-vascularesFamilial HypercholesterolemiaGenetic VariantsCardiovascular DisesasesFunctional Studiesmaster thesis