Romão, LuísaLuchessi, AugustoSilva, Joana2020-05-282022-11-012019-11-22http://hdl.handle.net/10400.18/6866Tese de doutoramento em Biologia (Biologia de Sistemas), apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019.Orientadora: Doutora Luísa Romão (INSA) e Co-Orientador: Doutor Augusto LuchessiShort upstream open reading frames (uORFs) are cis-acting elements located within the 5'- leader sequence of transcripts. Recent genome-wide ribosome profiling (RiboSeq) studies have demonstrated the widespread presence of uORFs in the transcriptome and have shown that many uORFs can initiate with non-AUG codons. uORFs can impact gene expression of the downstream main open reading frame (mORF) by triggering messenger RNA (mRNA) decay or by regulating translation. Thus, disruption, elimination or creation of uORFs can elicit the development of several genetic diseases, such as cancer. The ATP-binding cassette subfamily E member 1 (ABCE1) gene, belongs to the ABC gene family of transporters. However, it does not behave as a drug transporter like the other members of this family. ABCE1 actively participates in the different stages of the translation process and is involved in cell proliferation and anti-apoptotic signaling processes, associating ABCE1 to a potential oncogenic function. RiboSeq occupancy profiles of the ABCE1 mRNA 5’-leader sequence indicate an active translation associated with the presence of uORFs, which is suggestive of a high translational regulation. Our aim was to study the translational regulation mediated by the five AUG and five non- AUG uORFs present in the human ABCE1 5’-leader sequence in colorectal cancer. With this purpose, we constructed a set of Firefly luciferase (FLuc) reporter vectors derived from the wild-type one containing the native configuration of the human ABCE1 5’-leader sequence upstream of the FLuc ORF, and transiently transfected colorectal cancer HCT116 cells. Here we show that ABCE1 mORF expression is regulated by its uORFs. Our results are consistent with a model wherein uORF1 recruits ribosomes onto the mRNA, behaving like a ribosomal barrier. The ribosomes that efficiently bypass uORF1 and/or uORF2, must probably reinitiate at uORF3 and/or uORF5, while uORF4 is greatly bypassed. uORF3 and uORF5 function as repressive uORFs that may cooperate to reach a maximum repression of the mORF. Thus, both bypass and reinitiation events of the AUG uORFs within ABCE1 5’-leader sequence contribute for the translational control of the mORF. In constrast, the non-AUG uORFs seem to be devoided of a significant inhibitory activity. The AUG uORF-mediated translational control is maintained in normal and in endoplasmic reticulum (ER) stress conditions, which keeps the expression level of ABCE1 at a minimum, showing that ABCE1 is a resistant transcript whose functions are equally essential in normal and in coditions of global translation impairment. In addition, we show that ABCE1 uORF-mediated translational regulation is preserved in non-tumorigenic and cancerous cells, which is consistent with a lack of an oncogenic function by the uORFs, as well as ABCE1 himself, in the colorectal cancer cell line tested. This study contributes with an additional example of how uORF-mediated translational regulation can occur. In addition, it reveals how important is to screen the 5’-leader sequence of the transcripts in search for potential disease-related variants. This information might be relevant for the implementation of new diagnostic and/or therapeutic tools for diseases associated with the deregulation of uORF-mediated translational control.A expressão génica é extremamente regulada ao nível da tradução do RNA mensageiro (mRNA), sendo que por sua vez, este processo é dividido em diferentes fases: iniciação, alongamento, terminação e reciclagem dos ribossomas. A etapa da iniciação é vista como o passo limitante do processo de tradução, e é por isso altamente regulada pela existência de vários elementos regulatórios localizados na região 5’-não traduzida dos transcritos. De entre estes elementos que actuam numa configuração em cis, salientamos as pequenas grelhas de leitura a montante (do inglês, upstream open reading frames, uORFs). Estes elementos reguladores são potencialmente traduzidos e são definidos por um codão de iniciação na região 5’-não traduzida do mRNA e um codão de terminação localizado a montante ou sobreposto com a grelha de leitura principal (do inglês, main open reading frame, mORF). Estudos rescentes do perfil de ribossomas (do inglês, ribosome profiling, RiboSeq) monstraram a presença generalizada de uORFs no transcritoma, revelando ainda que uma grande maioria das uORFs inicia a sua sequência com codões não-canónicos diferindo em um nucléotido do codão de iniciação comummente usado, o AUG. É de facto estimado que aproximadamente metade dos transcritos têm pelo menos uma uORF. Estes elementos surgem em determinadas classes de transcritos, como é o caso dos fatores de transcrição, recetores celulares, oncogenes e genes envolvidos no crescimento e diferenciação celular. As uORFs regulam a expressão génica da sua mORF ao desencadearem a degradação do mRNA ou por regularem a tradução. Em condições fisiológicas normais, estes pequenos elementos regulatórios inibem a tradução da respetiva mORF, obtendo-se uma repressão da expressão de 30 a 80%. A inibição da expressão da mORF depende em grande parte de um contexto de Kozak forte envolvendo o codão de iniciação da uORF, bem como de outras características, como por exemplo, uma longa distância entre a extremidade 5’ do transcrito e o início da sequência da uORF, a presença de múltiplas uORFs, uma longa uORF e/ou uma pequena distância entre o codão de terminação da uORF e o início da mORF. A repressão da tradução induzida por uma uORF pode ser devida a um bloqueio dos ribossomas aquando da tradução da uORF ou por dissociação e reciclagem dos mesmos após terminação da tradução da uORF. Em condições de stress, as uORFs podem ser vistas como elementos que permitem a tradução da mORF. Isto pode acontecer através de mecanismos de reiniciação da tradução após tradução da uORF ou por não reconhecimento do codão de iniciação da uORF (do inglês, leaky scanning ou ribosomal bypass), levando a que os ribosomas iniciem a tradução no codão de iniciação da mORF. Desta forma, compreende-se que a disrupção, eliminação ou criação de uORFs pode levar ao desenvolvimento de várias doenças genéticas, como é o caso do cancro. O gene ABCE1 (do inglês, ATP-binding cassette subfamily E member 1) pertence à família de genes transportadores ABC. Contudo não se comporta como um transportador de drogas como os outros membros desta família pelo facto de não apresentar domínios transmembranares. A proteína ABCE1 participa ativamente nas diferentes fases do processo de tradução, bem como, nos processos de proliferação celular e evasão da morte celular por apoptose, sugerindo que esta proteína pode ter funções oncogénicas. A ocupação ribosomal da sequência 5’-não traduzida do mRNA do gene ABCE1 obtida por estudos de RiboSeq, é indicativa de uma tradução activa nesta região que por sua vez parece estar associada com a presença de uORFs, as quais poderão estra envolvidas no controlo traducional da expressão da mORF. Para além disso, dados de RiboSeq numa linha celular de cancro coloretal, HCT116, mostraram a existência de pequenas ORFs que iniciam com codões de iniciação não-canónicos na região 5’-não traduzida do transcrito ABCE1. Paralelamente, foram também identificadas bioinfomaticamente uORFs iniciadas em AUG para este transcrito. Contudo, não foi realizado nenhum estudo experimental para investigar a função biológica das uORFs no mRNA do ABCE1 humano. Tendo em conta a falta de informação relativamente às uORFs presentes na região 5’-não traduzida do mRNA do ABCE1, o objectivo deste projecto foi o estudo da função biológica destas dez uORFs, tanto iniciadas em AUGs como em codões não-canónicos, em células do cancro coloretal. Para tal estabeleceram-se as seguintes tarefas: (i) determinar o impato destas uORFs na expressão da respectiva mORF; (ii) identificar os mecanismos pelos quais estas uORFs regulam a tradução da mORF; (iii) determinar o impacto de condições de stress, nomeadamente condições de stress do retículo endoplasmático (do inglês, endoplasmic reticulum, ER), na regulação da tradução mediada por estas uORFs; e (iv) verificar se a regulação da tradução promovida por estas uORFs tem um papel no desenvolvimento tumoral do cancro coloretal. Para tal, a sequência de DNA complementar (cDNA) da região 5’-não traduzida do mRNA do ABCE1 humano foi clonada a montante da ORF da luciferase do pirilampo (do inglês, Firefly luciferase, FLuc), num vetor plasmídico, obtendo-se assim a contrução ABCE1_5’UTR. Foi realizada mutagénese dirigida neste vetor de forma a obter todas os construções necessárias. Cada uma destas construções foi transfetada transitóriamente na linha celular HCT116, simultaneamente com um vector que expressa a luciferase da Renilla como controlo. Após lise celular, os lisados proteicos foram analisados através de ensaios de luminometria. Os nossos resultados mostram que as uORFs presentes na região 5’-não traduzida do mRNA do ABCE1 humano têm impacto na tradução da respetiva mORF, como demonstrado pela redução de 70% da actividade relativa da luciferase após transfeção com a contrução ABCE1_5’UTR. Esta repressão da mORF do mRNA do ABCE1 é promovida principalmente por duas uORFs iniciadas em AUG, a uORF3 e a uORF5, as quais parecem ter um efeito aditivo de forma a alcançar um máximo de repressão da mORF. As restantes uORFs iniciadas em AUG do transcrito ABCE1 (uORF1, uORF2 e uORF4) não apresentam capacidade inibitória significativa. Embora todos os AUGs das cinco uORFs tenham o potencial de serem reconhecidas pela maquinaria de tradução, destas uORFs, a uORF1 e uORF5 são eficientemente reconhecidas devido aos seus codões de iniciação terem uma sequência de Kozak mais forte. Após a sua tradução, ocorre reiniciação da tradução no codão de iniciação seguinte que se encontre nas condições mais adequadas à tradução. Contrariamene, a uORF2, uORF3 e uORF4 são menos eficientemente reconhecidas. No conjunto, as cinco uORFs iniciadas em AUG regulam a tradução da sua mORF através de mecanismos de reiniciação da tradução e leaky scanning. Em contraste, as uORFs iniciadas em codões não-canónicos não apresentam uma capacidade inibitória significativa. A regulação da tradução do mRNA do ABCE1 promovida pelas uORFs iniciadas em AUG foi mantida quer em condições normais ou de stress do ER, indicando que a expressão da proteína ABCE1 deve ser mantida num determinado nível para exercer as suas funções na célula mesmo em condições de inibição global da tradução. O padrão de regulação por estas uORFs é igualmente mantido em células do cancro coloretal bem como em células não tumorais do cólon (linha celular NCM460), mostrando que as mesmas não têm impacto no processo tumorigénico, o que por sua vez é concordante com um papel não-tumorigénico da proteína ABCE1 na linha de cancro coloretal testada. Este estudo constitui um exemplo adicional sobre os mecanismos subjacentes à regulação da tradução do mRNA mediada por uORF(s). Além disso, revela o quão importante é a análise da região 5’-não traduzida dos transcritos de modo a identificar potenciais variantes associadas a doenças genéticas. Esta informação poderá ser relevante para a implementação de novas ferramentas de diagnóstico e/ou terapêuticas para doenças associadas à desregulação do controlo traducional mediado por uORF(s).engTranslational RegulationuORFsnon-AUG uORFsABCE1Colorectal CancerGenómica Funcional e EstruturalDoenças GenéticasRegulação da TraduçãoCancro Colorectaldoctoral thesis