Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.18/4292
Título: The effect of G418 and PTC124 as suppression therapy for beta-thalassemia
Autor: Estima, Cláudia
Orientador: Romão, Luísa
Menezes, Juliane
Palavras-chave: Genómica funcional e Estrutural
Expressão Génica
Terapia de Supressão
Tradução do RNA Mensageiro
Mutação nonsense
G418
PTC124
Messenger RNA Translation
Nonsense Mutation
Suppression Therapy
Data de Defesa: 2016
Resumo: Nonsense mutations are alterations that introduce, prematurely, in the coding region of the messenger RNA (mRNA), a translational termination codon. Nonsense mutations or premature termination codons (PTCs) can arise from various types of mutations in germ or somatic cells. PTCs promote premature translational termination and, in most cases, the induction of nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a quality control pathway that recognizes and rapidly degrades mRNAs that contain PTCs, preventing the synthesis of C-terminally truncated proteins, possibly toxic for the cell. In recent years, a therapeutic approach called suppression therapy is being developed using low molecular weight compounds to induce the translation machinery to recode a PTC into a sense codon. Beta thalassemia is one of the most common genetic diseases worldwide, being characterized by reduced or absent beta globin chain synthesis, resulting in diminished hemoglobin in red blood cells, increased red blood cells production and anemia. Some studies have shown that aminoglycosides and non-aminoglycosides can suppress PTCs in cystic fibrosis and Duchenne’s muscular dystrophy, but it remains unclear whether beta thalassemia would also be responsive to a similar drug treatment. Preliminary results obtained in our lab have shown that the aminoglycoside G418 (geneticin) can suppress a nonsense mutation at codon 39 of the human beta globin mRNA, although at low levels in cultured erythroid cells. To investigate if suppression therapy can restore enough beta globin protein to possibly correct the disease manifestations of beta thalassemia, HeLa cells were transfected with plasmids containing the human beta globin wild type gene (BN) or the counterpart carrying a nonsense mutation at codon 39 (B39). HeLa cells were then treated with G418 or PTC124 (ataluren) to ascertain if these compounds are able to induce efficient levels of suppression, in a dose-dependent manner. Our results showed that G418 produces slight differences between the treated and untreated samples, and so it is not clear if the compound is capable of restoring beta globin. Results from PTC124 treatment were somehow inconsistent because the increase of the mRNA levels was not identical throughout the experiments, although it is quite normal considering a testing phase. On the other hand, PTC124 increased nearly 4-fold the mRNA levels of the B39 transcript when comparing with the B39 without treatment, which may indicate a possible effect of the drug, although the observed differences are not statistically significant. To obtain more clarifying results we suggest testing more drug concentration ranges. Due to the fact that we were unable to test the effect of the drug on the protein level, in the future it would be of great interest to evaluate the effect of these two compounds on protein expression levels. Additionally, since suppression therapy is an extremely difficult approach to achieve efficient results, future methodologies should combine this therapy with others, for example, NMD inhibition.
A beta talassémia é uma doença genética que se caracteriza pela redução ou ausência de síntese de beta globina, um dos constituintes da hemoglobina, resultando na escassez de glóbulos vermelhos e, consequentemente, em anemia. Uma das causas desta doença tem origem na alteração de um nucleótido, levando à introdução de um codão de terminação prematura (na sigla inglesa PTC ou codão nonsense) nos transcritos de beta globina. A presença de um PTC não permite que a tradução progrida normalmente, ocorrendo, na maior parte dos casos, a formação de péptidos truncados que são, possivelmente, não funcionais ou, até, tóxicos para a célula. No sentido de devolver a homeostase, a célula desenvolveu mecanismos de controlo de qualidade para assegurar a fidelidade da expressão genética. Entre estes mecanismos está o decaimento do RNA mensageiro (mRNA) mediado por mutações nonsense (na sigla inglesa NMD – nonsense mediated mRNA decay) que permite identificar e degradar transcritos que contenham um PTC, reduzindo a sua abundância. Deste modo, a eliminação destes transcritos anómalos evita a formação e acumulação de proteínas truncadas que, caso contrário, danificariam a célula. Assim, o NMD tem, na maioria dos casos, um papel protetor contra erros genéticos. A degradação do transcrito que contém o PTC inicia-se logo após a exportação da ribonucleoproteína mensageira (na sigla inglesa mRNP) para o citoplasma. Durante a ronda pioneira de tradução, se o transcrito não possuir um PTC, o ribossoma remove da mRNP todos os complexos de junção exão-exão (na sigla inglesa EJC) até chegar ao codão de terminação. Os EJC são complexos multiproteicos, depositados 20 a 24 nucleótidos (nt) de distância a montante das junções exão-exão (local de excisão dos intrões) durante o splicing. Se, por ventura, o transcrito possuir um PTC e este se localizar a, pelo menos, 50 a 55 nt de distância a montante da última junção exão-exão, a tradução é terminada prematuramente e pelo menos um EJC fica associado ao mRNA. Nestas condições, o EJC facilita o recrutamento e a interacção dos factores do NMD com o complexo de terminação da tradução, activando o NMD. Este é o caso mais comum, no qual o transcrito é degradado, reduzindo os seus níveis drasticamente (entre 0 a 20% dos níveis normais). Como exemplo para esta situação temos o caso do transcrito de beta globina com uma mutação nonsense no codão 39. Contudo, esta regra posicional dos EJC não é tão linear como aparenta, dado que existem transcritos que, mesmo estando nas condições previstas pelo modelo, conseguem resistir à acção do NMD, como é o caso de mRNAs que contenham PTCs próximos do codão de iniciação. Como exemplo de um mRNA que escapa à degradação pelo NMD, temos o transcrito de beta globina que possui uma mutação nonsense no codão 15, sendo que os seus níveis de expressão são semelhantes aos do gene da beta globina normal. De facto, verificou-se que existem outras características do mRNA, para além dos EJC, que influenciam a activação do NMD, tais como distância física entre um PTC e a proteína citoplasmática de ligação à cauda poli-A do mRNA (na sigla inglesa PABPC1). Para além disso, o tamanho da região não traduzida a 3’ (na sigla inglesa 3’UTR) é outro dos fatores que influencia a ativação do NMD. Apesar de, na maioria dos casos, o NMD assumir um papel protector, este pode também pode agravar o fenótipo da doença pelo facto de eliminar mRNAs que originam proteínas parcialmente funcionais ou com actividade residual. O processo de terminação da tradução ocorre quando o codão stop é reconhecido por proteínas que formam o complexo de terminação, promovendo a libertação da cadeia polipeptídica formada até então. Em certos casos, ao invés de ser reconhecido pelo complexo de terminação, o codão stop é identificado por um aminoacil tRNA, complementar a duas das três bases (na terminologia inglesa near cognate aminoacyl tRNA). Ocorre, assim, a recodificação do codão de terminação prematura, permitindo que a elongação prossiga em fase, até que o ribossoma atinja um codão stop normal, possibilitando a formação da proteína completa e potencialmente funcional. Este processo de readthrough de um PTC ocorre espontaneamente na célula, embora não seja frequente (cerca de 1%). No entanto, certas moléculas de baixo peso molecular demonstram elevar a frequência destes acontecimentos, uma vez que favorecem a competição entre os near cognate aminoacyl tRNAs e o complexo de terminação. Desta forma, nas últimas décadas tem sido desenvolvida uma terapia, designada como terapia de supressão, que utiliza estes compostos com vista a aliviar os sintomas de diversas doenças causadas por mutações nonsense, devido ao aumento da quantidade de proteína funcional disponível. Os compostos mais estudados e utilizados na terapia de supressão são os aminoglicosídeos, um grupo de antibióticos cujo potencial de supressão provém da sua capacidade de reduzir a fidelidade na incorporação dos aminoácidos (na terminologia inglesa misincorporation), promovendo a introdução de near cognate aminoacyl tRNAs. À parte dos aminoglicosídeos, existe um composto, o PTC124, que tem vindo a ser alvo de grande interesse devido ao facto de não apresentar actividade antibacteriana nem toxicidade, assumindo um papel promissor no desenvolvimento da terapia de supressão. Este trabalho teve como objectivo investigar se os dois compostos a testar, o aminoglicosídeo G418 (geneticina) e o não-aminoglicosídeo PTC124 (atalureno), possuem a capacidade de aumentar os níveis de beta globina normal para, possivelmente, atenuar as manifestações da beta talassémia devido a mutações nonsense. Para tal, foi delineada uma estratégia experimental, que consiste em transfectar células HeLa com plasmídeos que contêm o gene da beta globina humana normal (BN) ou o equivalente com uma mutação nonsense no codão 39 (B39), expondo-as aos dois compostos. No final, foram analisadas as diferenças nos níveis de mRNA, consoante as concentrações utlizadas. Os nossos resultados mostraram que o G418 produz diferenças subtis entre as amostras tratadas e não tratadas, não sendo claro se o composto é capaz de aumentar os níveis de mRNA da beta globina, no o modelo experimental usado. Os resultados relativamente ao composto PTC124 foram, de certa forma, inconsistentes, uma vez que o aumento dos níveis de mRNA não foi idêntico ao longo das experiências, embora seja bastante normal aquando de uma fase de testes. Ainda assim, o PTC124 induziu o aumentou de 4 vezes os níveis de mRNA do transcrito B39 na concentração de 100µM, quando comparamos com o B39 sem tratamento, o que pode indicar um possível efeito da droga, embora as diferenças observadas não sejam estatisticamente significativas. De modo a obter resultados mais esclarecedores, é aconselhável testar diferentes concentrações para ambas as drogas. Devido ao facto de não ter sido possível testar o efeito das drogas relativamente à sua expressão proteica, no futuro seria de grande interesse avaliar o efeito destes dois compostos a este nível. Para além disso, a utilização de outro modelo celular, como as células MEL (murine erythroleukemia), seria de grande interesse, devido ao facto de se tratar de células eritróides. Uma vez que a terapia de supressão é uma abordagem na qual é extremamente difícil alcançar resultados consistentes, reprodutíveis e satisfatórios, futuramente é recomendável acoplar esta terapia com outras metodologias, por exemplo, a inibição NMD. Apesar da investigação no ramo da terapia de supressão ser bastante complexa e exigente, é de recordar que este tratamento não se foca nos sintomas, mas sim na origem molecular de muitas doenças genéticas.
Descrição: Dissertação de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2016
Orientadora: Luísa Romão, Investigadora do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge
Peer review: no
URI: http://hdl.handle.net/10400.18/4292
Versão do Editor: https://repositorio.ul.pt/handle/10451/26387
Aparece nas colecções:DGH - Dissertações de mestrado

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