Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.18/3187
Título: Anemias de causa hereditária - anemia ferropénica refratária ao tratamento com ferro e talassémias - base molecular e fatores genéticos modificadores
Autor: Gonçalves, Lúcia
Orientador: Faustino, Paula
Correia, Leonor
Palavras-chave: Anemia Ferropénica
IRIDA
TMPRSS6
Matriptase-2
Genes Modificadores
Doenças Genéticas
Talassémias
Variantes de Hemoglobina
MLPA
Hemoglobinopatias
Hereditary Anaemias
Haemoglobinopathies
Globin Genes
Data de Defesa: Fev-2015
Resumo: [pt] A anemia é um reconhecido problema de saúde pública. Esta, pode ser adquirida ou de caracter hereditário, subjacente a alterações em genes relacionados com o metabolismo do ferro ou em genes que codificam as várias globinas, constituintes da hemoglobina. Um exemplo é o gene TMPRSS6, que codifica a matriptase 2, proteína reguladora da expressão da hormona hepcidina. Mutações neste gene levam a uma anemia microcítica e hipocrómica refratária ao tratamento com ferro oral denominada de Iron Refractory Iron Deficiency Anaemia que é uma doença genética rara e com transmissão autossómica recessiva. Para além das variantes patogénicas associadas à Iron Refractory Iron Deficiency Anaemia, estudos de associação revelaram que alguns polimorfismos neste gene se encontram associados a risco aumentado para o desenvolvimento de anemia ferropénica. As hemoglobinopatias são as anemias hereditárias mais frequentes no mundo. Apresentam uma transmissão autossómica recessiva e podem ser devidas a um défice quantitativo das cadeias globínicas (talassémias) ou a alterações estruturais nas cadeias de globina (variantes estruturais). Neste trabalho pretendeu-se identificar a base molecular de alguns casos clínicos suspeitos de IRIDA, esclarecer se variantes polimórficas no gene TMPRSS6 são fatores genéticos modificadores do fenótipo hematológico e do metabolismo do ferro e, ainda, investigar molecularmente casos de hemoglobinopatias com fenótipos atípicos. As regiões codificantes e as junções exão/intrão do gene TMPRSS6 foram amplificadas pela reação da polimerase em cadeia e sequenciadas pelo método de Sanger, em 6 indivíduos que apresentavam um fenótipo compatível com Iron Refractory Iron Deficiency Anaemia. Nesse gene, O SNP rs855791, foi caracterizado usando uma técnica de amplificação específica de alelo, em 89 mulheres com fenótipos normais a nível hematológico e nos parâmetros do metabolismo do ferro e em 25 mulheres com anemia ferropénica. Na investigação molecular das hemoglobinopatias foram amplificadas por PCR e sequenciadas pelo método de Sanger as regiões codificantes dos genes globínicos (HBB, HBD, HBG) assim como as regiões de junção exão/intrão e, nalguns casos, as regiões regulatórias proximais. Foram pesquisadas grandes deleções através da metodologia de Multiplex Ligation Probes Assay.. Com este estudo conclui-se que a investigação molecular do gene TMPRSS6 é útil no diagnóstico de Iron Refractory Iron Deficiency Anaemia e no esclarecimento de quadros de anemias ferropénicas graves e crónicas. Conclui-se, também, que nas mulheres portuguesas o alelo T e o genótipo TT do SNP rs 855791 se encontram associados a risco aumentado para o desenvolvimento de anemia ferropénica. A investigação molecular de hemoglobinopatias revelou-se muito útil para esclarecer alguns fenótipos atípicos de talassémias. Foram também identificadas variantes estruturais raras da hemoglobina, tais como a Hb Maputo e Hb G-Coushata. Para além disso, foi identificada uma grande deleção localizada a montante do agrupamento génico da alfa-globina que remove a região regulatória distal. Esta lesão molecular é responsável por alfa-talassémia, embora os genes da alfa-globina se encontrem estruturalmente intatos. Os resultados deste trabalho contribuíram para melhorar o conhecimento da base molecular e da fisiopatologia das anemias hereditárias, em Portugal.
[eng] Anaemia is a recognized public health problem, affecting about one-quarter of the world’s population. Its origin may be related with nutritional factors (ex. being subjacent to an iron deficient diet) or it may have a genetic origin (hereditary anaemias). The latter group includes anaemias mainly caused by mutations in iron metabolismrelated genes or in globin genes. The iron metabolism-related gene TMPRSS6 codes for a membrane-bound serine protease, the matriptase-2, which plays an essential role in down regulation the hormone hepcidin, the key regulator of iron homeostase. Loss-of- function mutations in this gene lead to a severe and rare microcytic and hypochromic anaemia with an autosomal recessive way of transmission, named Iron Refractory Iron-Deficiency Anaemia (IRIDA). Common genetic variants in this gene have been reported as modulators of haematological phenotype and serum iron biomarkers, and suggested to be genetic risk factors to the development of iron deficiency anaemia. Haemoglobinopathies are the most common hereditary anaemias in the world. They have an autosomal recessive transmission and may be caused by a quantitative deficit of globin chain synthesis (thalassemias) or may be due to structural changes in the globin chains (hemoglobin variants). In this study, we aimed: i) to identify the molecular basis of some IRIDA-like clinical cases; ii) to clarify whether polymorphic variants in the TMPRSS6 gene are modifiers of the haematological phenotype and the levels of serum iron metabolism biomarkers, and iii) to perform molecular studies in order to elucidate some cases of haemoglobinopathies with atypical/rare phenotypes. In order to achieve the above objectives, the coding regions and exon/intron junctions of the TMPRSS6 gene of 6 IRIDA-like patients were amplified by polymerase chain reaction and sequenced by the Sanger method. Furthermore the SNP rs855791, in TMPRSS6 gene was characterized using an allele specific amplification methodology in a group of 25 women with iron deficiency anaemia and in another group of 89 women without iron deficiency anaemia (the normal control group). Concerning the clinical cases of haemoglobinopathies, the coding regions of three globin genes (HBB, HBD and HBG), the exon/intron junction regions and, in some cases, the proximal regulatory regions (promoter regions) were amplified by polymerase chain reaction and sequenced by the Sanger method. In addition, large deletions in the alpha-globin gene cluster were investigated by the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) methodology. The screening for mutations in the TMPRSS6 gene has revealed an already reported mutation associated with IRIDA, the c.57 A>G, pK253E, as well as a novel intronic variant c.1369+4 A>T that, by in silico studies seems to perturb the splicing. In addition, several common variants in this gene were found associated with iron deficiency anaemia susceptibility. Concerning the study performed in the portuguese women, the TT genotype of the SNP rs855791 was found associated with the lowest levels of haemoglobin and serum iron metabolism biomarkers. Its frequency is higher in the iron deficiency anaemia group. Thus, we can conclude that the common SNP rs855791 in TMPRSS6 gene is a genetic factor associated with an increased risk for the development of iron deficiency anaemia. So, the molecular study of this gene is useful in the diagnosis of IRIDA cases and in the clarification of severe and chronic ferropenic anaemias. The molecular investigation of haemoglobinopathies cases proved to be very useful to clarify complex phenotypes such as the coinheritance of alpha-thalassaemia with delta-thalassaemia, some cases of beta-thalassemia with normal HbA2 level or with unusual high levels of Hb F. We also identified rare haemoglobin structural variants - Hb Maputo and Hb G-Coushata. Moreover, a large deletion located upstream the alpha-globin cluster was identified, removing the distal regulatory region. This molecular lesion is responsible for an alpha-thalassemia phenotype although the alphaglobin genes are structurally intact. These results contributed to a better understanding of the molecular basis and the pathophysiology of hereditary anaemias in Portugal.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Análises Clínicas apresentado à Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 2015.
Trabalho realizado no Grupo de Investigação em Hemoglobinopatias, metabolismo do ferro e patologias associadas, Departamento de Genética Humana do INSA, sob a orientação de Paula Faustino.
Peer review: no
URI: http://hdl.handle.net/10400.18/3187
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