Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.18/2700
Título: Mecanismo de decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense e a iniciação da tradução
Autor: Barbeiro, Miguel
Orientador: Loison, Luísa Romão
Crespo, Ana Maria Viegas
Palavras-chave: Genómica Funcional e Estrutural
Expressão Génica
Plasmídeos
Cultura de Células
Data de Defesa: 10-Dez-2013
Resumo: [PT] A expressão génica nos eucariotas é um mecanismo celular que envolve múltiplas etapas interligadas, desde a transcrição à tradução proteica, nos quais o RNA mensageiro (mRNA) é um intermediário fulcral. O material genético armazenado nos cromossomas em forma de genes é constituído por DNA e é passado para uma molécula intermédia, o mRNA, através do processo de transcrição. Sendo esta molécula de mRNA o molde para a produção de proteínas através do mecanismo de tradução. Após a sua transcrição e ainda no núcleo, a maioria dos mRNAs eucarióticos sofre uma maturação onde lhe é introduzido um complexo proteico na extremidade 5' (estrutura cap) e uma cauda poli(A) na extremidade 3'. Após o seu transporte para o citoplasma inicia-se o mecanismo de tradução proteica. O processo da iniciação da tradução requer vários factores proteicos (eIF), entre eles, o elF4F liga-se à estrutura cap através da subunidade eIF4E. Outros constituintes deste complexo são o factor eIF4A, uma ATPase e helicase dependente de RNA, e o factor elF4G que se associa à subunidade ribossomal 40S através da interacção com a proteína e1F3. A proteína de ligação à cauda poli (A) (PABPCl) também interage com o factor eIF4G, o que resulta na circularização do mRNA. Actualmente, sabe-se que a complexidade do mecanismo bioquímico envolvido na tradução em eucariotas se reflecte em processos a montante, como por exemplo, no mecanismo de decaimento de mRNAs mediado por mutações nonsense (NMD). O mecanismo de NMD elimina rápida e selectivamente mRNAs portadores de codões nonsense [codões de terminação da tradução prematuros (PTCs)]. Estes codões não codificam aminoácidos e a sua presença em transcritos impede a tradução de proteínas completas. Se sintetizadas, as proteínas truncadas resultantes serão, provavelmente, não funcionais ou poderão mesmo ter um efeito deletério no metabolismo celular. O facto de aproximadamente um terço das doenças genéticas e muitas formas de cancro serem devidas a mutações nonsense, justifica o interesse no estudo do mecanismo de NMD e de como este processo multifacetado reflecte a complexidade da maquinaria de tradução do mRNA, assim modulando o fenótipo da doença genética humana. A identificação e caracterização dos mecanismos envolvidos no NMD e na regulação da tradução, em associação com determinada doença genética, ou em processos de tumorigénese, permitem o esclarecimento da etiopatofisiologia dessas doenças genéticas e do cancro que por sua vez, possibilitam o estabelecimento de novos biomarcadores com potencial aplicabilidade no rastreio, diagnóstico, prognóstico e/ou terapia deste tipo de doenças que, em muitos casos, são, nos países desenvolvidos, um problema de Saúde Pública. Uma questão fundamental para se conhecer o mecanismo de NMD, relaciona-se com a discriminação entre um PTC e um codão de terminação natural da tradução. Anteriormente, foi demonstrado que mRNAs portadores de codões de terminação próximos do AUG, i.e., portadores de uma pequena grelha de leitura (por exemplo, 15 codões), apresentam resistência ao NMD (Peixeiro, 2011). Mais recentemente, verificou-se que pelo facto do mRNA poder circularizar durante o processo de tradução, a proteína PABPCl pode localizar-se na proximidade de um ribossoma em terminação da tradução, competindo pela ligação entre este e a maquinaria de NMD, tendo como consequência a inibição do mecanismo de NMD (Silva e Romão, 2009). O objectivo deste projecto é investigar as interacções proteicas envolvidas no mecanismo de tradução, utilizando complexos de pré-iniciação, iniciação e terminação da tradução formados in vivo (linha celular HeLa)em mRNAs modelo da beta-globina humana normal ou com uma mutação nonsense no codão 39 e de que modo estas interacções estão também envolvidas no mecanismo de NMD.
[ENG] Gene expression in eukaryotic cell is a mechanism that involves many interrelated steps from transcription to protein translation, in which the messenger RNA (mRNA) is the key intermediate. The genetic material stored in the form of chromosomes consists of DNA organized as genes and is passed to an intermediate molecule, mRNA, through the process of transcription, being the mRNA molecule the template for production of proteins via translation mechanism. After transcription, the majority of eukaryotic mRNAs are subjected to a maturation where is removed the introns and is introduced a protein complex at the 5'(cap structure) and a poly (A) tail at the 3' end. After transport to the cytoplasm the mechanism of protein translation starts. The process of initiation of translation requires several protein factors (eIF), including the eIF4F that binds to the cap structure via the eIF4E subunit. Other constituents of this complex are factor eIF4A, an ATPase and helicase dependent RNA, and eIF4G factor that is associated with the 40S ribosomal subunit through interaction with the protein eIF3. The binding protein poly (A) tail (PABPC1) also interacts with factor eIF4G, which results in circularization of the mRNA. Currently, it is known that the complexity of biochemical mechanism involved in translation in eukaryotes is reflected in processes, such as the mechanism of mRNA decay mediated by nonsense mutations (NMD). The mechanism of NMD rapidly and selectively eliminates mRNAs carrying nonsense codons [premature translation termination codons (PTCs)]. These codons do not have any correspondent amino acid and mRNAs carrying PTCs are subjected to degradation. However, if these truncated proteins are synthesized, are likely to be non-functional or may even have a deleterious effect on cell metabolism. The fact that approximately one third of genetic diseases and many forms of cancer are caused by nonsense mutations, justifies the interest in the study of the mechanism of NMD and how this multifaceted process reflects the complexity of the machinery of translation of the mRNA, thereby modulating the phenotype of human genetic disease. The identification and characterization of the mechanisms involved in the regulation of NMD and translation in association with particular genetic disease or tumorigenesis process, allows the establishment of new biomarkers with potential applicability in screening, diagnosis, prognosis and / or therapy of these diseases, which in many cases are in developed countries, a public health problem. 7 A key issue to know the mechanism of NMD, relates to the discrimination between one PTC and a natural termination codon of translation. Previously, it was shown that patients with mRNAs stop codons near the AUG, ie, patients with a small reading frame (for example, the beta-globin mRNAs carrying a PTC on codon 15) have resistance to NMD (Peixeiro, 2011). More recently, it has been found that due to the mRNA circularization during the translation process, the protein PABPC1 may be located near the translation terminating ribosome and competing for the connection between this and the NMD machinery, resulting in the NMD inhibition mechanism (Silva e Romão, 2009). The aim of this project is to investigate protein interactions involved in translation mechanism using pre-initiation, translation initiation and termination complex formed in vivo (HeLa cell line) using mRNAs of the wild-type human beta-globin or carrying a nonsense mutation in codon 39, and how these interactions are also involved in the mechanism of NMD.
Descrição: Dissertação de mestrado em Biologia (Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2013
Luísa Romão Loison - Investigadora do INSA
Peer review: yes
URI: http://hdl.handle.net/10400.18/2700
Versão do Editor: http://repositorio.ul.pt/handle/10451/9832
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