Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.18/2107
Título: Aplicabilidade da PCR em tempo real na amplificação de DNA cianobacteriano em amostras preservadas.
Autor: Churro, Catarina
Pereira, Paulo
Valério, Elisabete
Vasconcelos, Vitor
Palavras-chave: PCR em Tempo Real
Cianobactérias
Soluto de Lugol
Data: 11-Jul-2013
Editora: Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP
Resumo: O estudo e monitorização de florescências de cianobactérias envolve frequentemente o uso de amostras fixadas a fim de evitar a sua degradação. Com o aumento das técnicas moleculares disponiveis, a possibilidade de utilizar este recurso de DNA para explorar informação genética representa uma mais valia na investigação em cianobacterias e toxinas associadas. Neste trabalho, determinou-se a quantidade e qualidade do DNA cianobacteriano recuperado a partir de amostras ambientais e de culturas fixadas com (1) solução de Lugol, (2) formaldeído, (3) gluteraldeído e (4) solução de Transeau. A quantificação e capacidade de amplificação do DNA extraído foi avaliada por PCR em tempo real utilizando como fragmento alvo o gene rpoC1. A extração foi feita com fenol-cloróformio e a pureza do DNA foi determinada espectrofotometricamente pela razão DO260/DO280 e DO260/DO230. As amostras foram analisadas em 5 diluições seriadas de 1:10 para determinar o limite de detecção e a eficiência da reacção. A amplificação das várias diluições por PCR em tempo real foi comparada com a amplificação em PCR convencional. Nas amostras fixadas com solução de Lugol ou formaldeído, a quantidade de DNA obtido foi inferior à quantidade obtida na amostra controlo (sem fixação). Contudo obteve-se DNA de boa qualidade (DO260/DO280> 1,86 e DO260/DO230> 2,22). Na análise por PCR em tempo real o fragmento alvo foi amplificado exponencialmente, com réplicas consistentes e uma eficiência de 0,91 (r2=0,99; m=-3,55) para a solução de Lugol e eficiência de 1.02 (r2=0,98; m=-3,28) para o formaldeído. No entanto a quantificação do gene alvo nestas duas amostras foi significativamente inferior à do controlo o que indica que o gene alvo pode ser quantificado mas a sua concentração não pode ser extrapolada para concentração real da amostra não fixada. Todas as diluições das amostras referidas anteriormente foram amplificadas enquanto que por PCR convencional só se obteve produto nas três primeiras diluições, o que indica maior sensibilidade do PCR em tempo real para a amplificação de amostras fixadas. Para a fixação com a solução de Transeau e gluteraldeído obteve-se DNA de fraca qualidade (DO260/DO280 <1,6) o que influenciou a quantificação espectrofotométrica, assim como a análise do gene rpoC1 por PCR em tempo real, em que a amplificação não ocorreu correctamente e as réplicas foram inconsistentes.
Peer review: no
URI: http://hdl.handle.net/10400.18/2107
Aparece nas colecções:DSA - Apresentações orais em encontros internacionais

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