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Título: Signal transduction pathways involving the hypertension-related WNK1 and WNK4 protein kinases
Autor: Mendes, Ana Isabel
Palavras-chave: WNK protein kinases
GLUT1 glucose transporter
CFTR
Syk
osteoporosis
hypertension
Vias de Transdução de sinal e Patologias Associadas
Issue Date: 5-Jul-2011
Resumo: The genes WNK1 and WNK4 belong to the subfamily of WNK protein kinases and their mutation causes pseudohypoaldosteronism type II, a rare familial form of hypertension with hyperkalemia and hypercalciuria. The molecular mechanisms underlying this condition involve the regulation of renal electrolyte homeostasis and the modulation of diverse ion channels and transporters via WNK kinases. Additionally, WNKs have also been reported to participate in signal transduction pathways related to cell survival and proliferation. The objective of the present thesis was to identify novel WNK1 and WNK4 interacting proteins and the underlying signal transduction pathways. First, it was found that WNK1 forms a protein complex with the Rab-GAP TBC1D4 and phosphorylates it in vitro. It was shown that the expression levels of WNK1 regulate surface expression of the constitutive glucose transporter GLUT1 in HEK293 cells. WNK1 is shown to increase the binding of TBC1D4 to regulatory 14-3-3 proteins while reducing its interaction with the exocytic small GTPase Rab8A. Moreover, these effects were kinase activity-dependent. Together, the data describe a pathway regulating constitutive glucose uptake via GLUT1, the expression level of which is related to several human diseases. Second, WNK4 was found to promote the cell surface expression of the CFTR chloride channel in mammalian cells. The mechanism by which WNK4 acts on CFTR involves interaction with the tyrosine kinase Syk, which we found to phosphorylate tyrosine 512 (Tyr512) in the first nucleotide-binding domain of CFTR. The presence of WNK4 prevents this in vitro phosphorylation in a kinase-independent manner. In BHK21 cells stably expressing CFTR, Syk reduces, while WNK4 promotes, the cell surface expression of CFTR. Mutation of Tyr512 revealed that its phosphorylation is a novel signal regulating the prevalence of CFTR at the cell surface and that WNK4 and Syk play an antagonistic role in this process. Finally, ten WNK4 variants were detected in a cohort of Portuguese patients and control individuals, which subsequently were tested for association to hypertension and/or osteoporosis. Despite none of the variants yield any significant association to hypertension, a rare missense alteration (rs56116165) in a highly conserved arginine residue showed a nominal association to osteoporosis. This finding advocates that this polymorphism is a rare allelic variant, in a candidate gene with a biological function in renal calcium homeostasis, that may contribute to a genetic predisposition to osteoporosis.
Os genes WNK1 e WNK4 pertencem à subfamília WNK de proteínas cinases e a sua mutação causa pseudohipoaldosteronismo tipo II, uma forma rara de hipertensão familiar com hipercalemia e hipercalciuria. Os mecanismos moleculares subjacentes a esta condição envolvem a regulação da homeostase renal de electrólitos e a modulação de diversos canais iónicos e transportadores via cinases WNK. Além disso, as WNKs também estão descritas como intervenientes em vias de transdução de sinal relacionadas com sobrevivência e proliferação celulares. O objectivo desta tese foi identificar novas proteínas que interajam com a WNK1 e a WNK4, e as vias de tradução de sinal subjacentes. Primeiramente, descobriu-se que a WNK1 forma um complexo proteico com a Rab-GAP TBC1D4, fosforilando-a in vitro. Mostrou-se ainda que os níveis de expressão da WNK1 regulam a expressão à superfície de células HEK293 do transportador da glucose GLUT1. A WNK1 aumenta a ligação da TBC1D4 às proteínas reguladoras 14-3-3, ao mesmo tempo que reduz a interacção com a pequena GTPase exocítica Rab8A. Estes efeitos são dependentes da sua actividade catalítica. Em conjunto, estes dados sugerem uma via que regula a entrada constitutiva da glucose na célula via GLUT1, cujo nível de expressão está relacionado com várias doenças humanas. Seguidamente, descobriu-se que a WNK4 promove a expressão do canal de cloro CFTR à superfície de células de mamífero. O mecanismo através do qual a WNK4 age sobre a CFTR envolve a interacção com a tirosina cinase Syk, a qual demonstrámos que fosforila o resíduo de tirosina 512 (Tyr512) no primeiro domínio de ligação ao ATP da CFTR. A presença da WNK4 impede esta fosforilação in vitro de forma independente da sua actividade de cinase. Em células BHK21 a expressar estavelmente a CFTR, a Syk reduz, enquanto a WNK4 promove, a expressão à superfície deste canal. Mutando a Tyr512 xi concluiu-se que a sua fosforilação é um novo sinal que regula a prevalência da CFTR à superfície das células e que a WNK4 e a Syk têm papéis antagonistas neste processo. Por fim, foram detectadas dez variantes da WNK4 num grupo de doentes e controlos portugueses, que posteriormente foram testadas para associação com a hipertensão e/ou osteoporose. Apesar de nenhuma ter apresentado associação significativa com a hipertensão, uma alteração missense rara (rs56116165) num resíduo de arginina altamente conservado apresentou uma associação nominal com a osteoporose. Com esta descoberta defendemos que esta alteração é uma variante alélica rara, num gene candidato implicado numa função biológica na homeostase renal do cálcio, que pode contribuir para uma predisposição genética para a osteoporose.
URI: http://hdl.handle.net/10400.18/103
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