http://hdl.handle.net/10400.18/56 Tue, 14 May 2013 21:41:08 GMT 2013-05-14T21:41:08Z http://hdl.handle.net/10400.18/1239 Title: Estudo Bioquímico e Molecular de Famílias com Hipercolesterolemia Familiar Authors: Raquel Gameiro Leitão, Flávia Abstract: Introdução: A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma patologia genética, caracterizada clinicamente por um aumento dos níveis de colesterol-LDL (c-LDL) no plasma, sendo maioritariamente causada por mutações no gene do receptor das LDL (gene LDLR). Mutações missense nos genes APOB ou PCSK9 podem causar fenótipos semelhantes. A FH sozinha ou em conjugação com outros factores de risco cardiovasculares pode promover o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCVs) prematuras. De acordo com a frequência da doença (1:500 indivíduos) estima-se que em Portugal existam cerca de 20.000 doentes com FH, porém esta encontra-se sub-diagnosticada. Até à data, apenas foram diagnosticados aproximadamente 550 doentes. O método de cascade screening (CS) permite a rápida identificação de indivíduos com FH numa família e foi descrito como custo-efectivo na identificação de novos doentes com FH. Objectivos: O principal objectivo deste trabalho foi, através do CS, aumentar o número de casos identificados com FH. Pretendeu-se ainda realizar a caracterização bioquímica de casos índex e respectivos familiares com FH, a fim de tentar correlacionar o genótipo e o fenótipo destes e compreender de que forma a FH e outros factores de risco cardiovascular influenciam o desenvolvimento de DCVs nesta população. Métodos: Para alcançar os objectivos propostos, estudaram-se 45 famílias, perfazendo um total de 194 indivíduos, 45 casos índex (cujo estudo molecular já havia sito realizado) e 149 familiares. As amostras de soro de casos índex e familiares foram analisados por electroforese de lipoproteínas para avaliação da presença de sdLDL e por métodos enzimáticos e colorimétricos automatizados para determinar a concentração de sdLDL e outras apolipoproteínas no soro. Após extracção de DNA dos familiares realizou-se a amplificação e sequenciação dos exões em que se detectou uma mutação no respectivo caso índex (gene LDLR, APOB). Foi ainda determinado o genótipo APOE de todos os indivíduos estudados. Os resultados da sequenciação foram analisados através do software staden package. Por fim realizou-se uma análise estatística de forma a interpretar os resultados obtidos. Resultados: A partir do estudo molecular aos 149 familiares, foram diagnosticados com FH 83 indivíduos (20 crianças e 63 adultos). Determinou-se que 71,79% das crianças e 76,62% dos adultos apresentam um genótipo APOE E3/E3, não se obtendo diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes alelos e o perfil bioquímico. Relativamente à estratificação das sdLDL, 65,52% das crianças e 72,88% dos adultos apresentam, maioritariamente, subfracções maiores e menos densas das LDL. Observou-se ainda que os níveis de Lipoproteína(a) são tendencialmente superiores em indivíduos com DCV. Da amostra total, 47,93% dos indivíduos com FH não estão ainda medicados. Porém, mesmo os indivíduos medicados apresentam um perfil lipídico de risco para o desenvolvimento de uma DCV prematura. Conclusão: O CS é um método cujo custo-benefício é extremamente eficaz. Sendo, no entanto, necessário, aumentar a adesão dos familiares. O CS permite identificar precocemente indivíduos com FH, que apresentam elevado risco cardiovascular, necessitando de intervenções farmacológica e de controlo de outros factores de risco adequadas. Os resultados obtidos demonstram que mais de 50% dos casos não tem o seu risco cardiovascular controlado, sendo essencial uma melhor compreensão sobre a dinâmica existente entre as DCVs e a FH.; [eng]; Familial Hypercholesterolemia (FH) is a genetic condition, clinically characterized by increased levels of LDL-cholesterol circulating in plasma and is mainly caused by mutations in receptor LDL (LDLR gene), but missense mutations in APOB and PCSK9 genes may also cause similar phenotypes. FH combined with the presence of other cardiovascular risk factors, may promote the development of premature cardiovascular diseases (CVD). According to the frequency of FH (1:500 individuals) estimated in Portugal, there are about 20.000 cases of FH, but is under-diagnosed. To date, only approximately 550 FH patients were identified. The Cascade Screening (CS) method allows the rapid identification of FH individuals with a family and was described as a cost-effective method to identify new FH patients. Objectives: The main goal of this work is, through CS, increase the number of individuals diagnosed with FH. It is also proposed to perform a biochemical characterization of index cases with FH and their relatives to try to correlate genotype and phenotype of these subjects and understand how the FH and other cardiovascular risk factors may influence the development of CVD in our population. Methods: To achieve these objectives we studied 45 families in a total of 194 individuals: 45 index cases (whose molecular study had already been done) and 149 relatives. Serum samples from index cases and relatives were analyzed for lipoproteins by electrophoresis and stratification of sdLDL. Through an automated enzymatic and colorimetric methods were quantified sdLDL and others apolipoproteins in serum samples, respectively. After de DNA extraction of relatives, the amplification and sequencing of the exon in which a mutation was detected in the respective index case (LDLR or APOB gene) was performed. It was further determined the APOE genotype for all the subjects in study. The sequencing results were analyzed using staden package software. At last, was performed a statistical analysis in order to interpret the results. Results: From the molecular study of 149 relatives, 83 were diagnosed with FH (20 children and 63 adults). It was determined that 71,79% of the children and 76,62% of the adults have E3/E3 APOE genotype. Through the sdLDL stratification, it was observed that 65.52% of children and 72.88% of adults have, mostly sub fractions larger and less dense LDL. It was also observed that the levels of Lipoprotein(a) tends to be higher in subjects with CVD. Of the total sample, 47,93% of individuals with FH are not yet treated. However, even individuals taking medication have a lipid risk for the development of a premature CVD. Conclusion: CS is a extremely cost-effective method. However, is necessary the increase of relatives adherence. The CS allows the early identification of individuals with FH who have high cardiovascular risk, requiring pharmacologic intervention and control of other cardiovascular risk factors. The results show that over than 50% of cases do not have their cardiovascular risk controlled and so is essential a better understanding of the dynamics between the CVD and FH. Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012.; Dissertação defendida e aprovada em 10 de Dezembro de 2012.; Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP, Grupo de Investigação Cardiovascular (Setembro 2011 – Setembro 2012).; Mafalda Bourbon: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP Mon, 10 Dec 2012 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10400.18/1239 2012-12-10T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.18/1238 Title: Genética molecular das Perturbações do Espectro do Autismo: Análise de variantes estruturais Authors: Isabel Neto Coelho, Joana Abstract: As Perturbações do Espectro do Autismo (PEA) são um grupo de doenças com uma forte etiologia genética que afectam o neurodesenvolvimento, caracterizando-se por dificuldades na interação social e comunicação e comportamentos repetitivos e estereotipados, sendo o seu diagnóstico baseado nos critérios presentes nos manuais de diagnóstico, como o DSM-V (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders). AS PEA tem uma elevada prevalência, o que torna importante o seu estudo genético, tendo já sido executados estudos em gémeos e famílias, análises citogenéticas, estudos de Linkage e de Associação, sequenciação de genes candidatos e do exoma e análise de variantes estruturais (Copy Number Variants, CNV). O principal objetivo deste trabalho foi a identificação de CNV patogénicos e loci de suscetibilidade para o autismo. Para isso, foram analisados os CNV identificados no rastreio genómico efetuado pelo Autism Genome Project (AGP), sendo realizada a validação de alguns dos CNV e identificados os seus pontos de quebra, sendo analisados os genes candidatos presentes e estabelecida uma relação entre o fenótipo clinico das crianças e os genes duplicados ou deletados. Nos CNV que se concluiu serem herdados foi, também, analisado o padrão de transmissão dos CNV herdados e feita uma correlação do seu conteúdo génico com traços autistas dos familiares. Foram ainda estudados os potenciais mecanismos que poderão estar na base do fenótipo de autismo. No decorrer do estudo, foram inicialmente escolhidos os CNV com base no seu tamanho e conteúdo génico, presentes nos cromossomas 3p22.1-22.2, 9q31.1, 11q14.3, 16p13.11-13.12 e 20p13. Para validar estes CNV, foi usada a técnica de PCR quantitativo em tempo real (Quantitative Real Time PCR, qPCR), sendo validadas duas duplicações, uma presente na zona 3p22.1-22.2, como sendo herdada do pai e outra na zona 20p13, que se verificou ser herdada da mãe. Foram ainda validadas as deleções existentes na banda 9q31.1, como sendo de novo e na banda 16p13.11-13.12, herdada numa das crianças e de novo noutra. A deleção na banda 11q14.3 revelou ser um falso positivo em dois indivíduos. Os pontos de quebra foram identificados nos CNV presentes nas regiões 9q31.1 e 20p13, com recurso a técnica de PCR de cadeia longa (Long Range PCR, LR-PCR). Alem disso, foi realizado um rastreio populacional da duplicação na região cromossómica 9q21.13, em 104 casos de autismo e 265 controlos e foi identificado um novo caso com esta duplicação, tendo sido sequenciados os seus pontos de quebra. Na análise do fenótipo clinico e da história familiar de cada criança com estes CNV, observou-se uma grande hetrogeneidade clinica das PEA, a nível da presença de deficiência mental e dos atrasos do desenvolvimento motor e da linguagem e, alguns deles, tinham uma história familiar de doenças psiquiátricas ou atrasos cognitivos. Depois da análise do padrão de transmissão dos CNV nas famílias em que este era herdado, pode-se concluir que ocorria uma co-segregação com traços autistas ou psicopatologias no individuo que transmite o CNV, em duas das famílias estudadas. Foi ainda realizada uma relação dos fenótipos das crianças com os genes afetados pelos CNV, concluindo-se que a maioria deles continha genes relacionados com o mecanismo de transmissão sináptica ou apresentavam funções importantes relacionadas com o desenvolvimento e plasticidade neuronais, como os genes ANXA1, SCN11A, MOBP, SLC44A1, GRIN3A, NDE1, NTNA1, PDYN, SIRPA. Futuramente e importante identificar um maior número de genes associados as PEA e os mecanismos moleculares envolvidos nesta patologia, o que será possível com o desenvolvimento das técnicas de sequenciação, que permitem identificar mutações genéticas significativas o autismo. Isto poderá permitir a descoberta de novos alvos terapêuticos, bem como o desenvolvimento de um teste genético para o diagnóstico molecular de autismo.; [eng] Autism Spectrum Disorders (ASD) are a group of conditions, with a strong etiology and they consist in a syndrome that affects neurodevelopment. They are characterized by impairments in social interaction and communication and presence of restricted and repetitive behaviours and their diagnostic is based in the diagnostic criteria present in the DSM-V. They have a high prevalence, wich means that it is important their genetic study, wich is based in studies in twins and families, cytogenetic analyses, linkage and association studies, candidate gene and exome sequencing and CNV analysis. The central objective of this work was the identification of pathogenic CNV and susceptibility loci for autism. There were analysed the CNV identified in the AGP genomic screen, with the validation and breakpoint identification of these CNV, the analysis of the candidate genes present, and the establishement of a relation between the clinical phenotype and the duplicated or delected genes. It was also analysed the transmission pattern of the heritable CNV, making a correlation with the autistic traces in the family members and studied the potential mechanisms in wich the autism phenotype is based. In this study, the CNV were chosen based on their size and genetic characteristics and there were chosen the CNV present in the regions 3p22.1-22.2, 9q31.1, 11q14.3, 16p13.11-13.12 e 20p13. To validate the CNV, we used the qPCR technique and there were validated two duplications, one inherited from the father in 3p22.1-22.2, and one in 20p13, inherited from the mother. Three deletions were also validated, one in the 9q31.1, appearing de novo and one in the 16p13.11-13.12 region, that was de novo in one child and inherited from the mother in the other one. It was also identified a false positive in the 11q14.3 in two individuals. The breakpoints were sequenced with the technique LR-PCR, in two CNV, 9q31.1 and 20p13. Furthermore, we have done a genomic screen of the 9q21.13 duplication, in 104 cases and 265 controls and it was identificated a new case with this duplication and the ponto de quebras were sequenced. Then, we realized a detailed analysis of the clinical phenotype and family history of the children with these CNV, wich conducted to the ASD clinical heterogeneity, presenting mental retardation e impairements in the motor development and of the language and, some of them, have a family history of psychiatric illness or cognitive impairements. We also analysed the transmissiona pattern of the heritable CNV, wich lead to the conclusion that there was a co-segregation with the autistic traits or pshycopatologies in the individual that transmitted the CNV, in two of the families. We also stablish a relation between the phenotype of the autistic children and the genes present in the CNV, that were, most of them, related to the synaptic transmission or have important functions in the neuronal development and plasticity, like ANXA1, SCN11A, MOBP, SLC44A1, GRIN3A, NDE1, NTNA1, PDYN, SIRPA. In future studies, it is important to identificate more genes associated to ASD and the mechanisms envolved, wich will be possible with the development of the sequencing techniques, that allow the identification of significative mutations to autism. This will allow the identification os novel therapeutical targets and the design of a genetic test,that could be involved in autism diagnostic. Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012.; Dissertação defendida e aprovada em 18 de Dezembro de 2012.; Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP, Grupo de Neurogenética e Saúde Mental (Setembro 2011 – Setembro 2012).; Astrid Moura Vicente: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP Tue, 18 Dec 2012 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10400.18/1238 2012-12-18T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.18/1236 Title: Estudo sobre a prevalência de fatores de risco cardiovascular numa amostra de adultos da Região de Lisboa Authors: Duarte, Elisete Guerreiro Description: Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Engenharia Lisboa da Universidade Católica Portuguesa, 2013.; Dissertação defendida e aprovada em 8 de Janeiro de 2013.; Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP, Grupo de Investigação Cardiovascular (Janeiro 2012 – Setembro 2012).; Mafalda Bourbon: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP. Tue, 08 Jan 2013 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10400.18/1236 2013-01-08T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.18/1235 Title: Estudo Molecular de Dislipidemias Familiares Authors: Andreia Paninho Berguete Coelho, Sara Abstract: A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma dislipidemia de transmissão autossómica dominante que se caracteriza por níveis elevados de colesterol no plasma e aparecimento prematuro de aterosclerose e de doença cardiovascular. Mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9 são causa de FH. A dislipidemia familiar combinada (FCHL) é uma hiperlipidemia poligénica também relacionada com a ocorrência de DCV prematura. O seu fenótipo tem sido associado a alterações nos genes LPL, APOC2, APOC3, APOA4 e APOA5. O objectivo deste trabalho consistiu na caracterização clínica e molecular de indivíduos com suspeita clínica de dislipidemia familiar, nomeadamente FH. Foi também objectivo do estudo a avaliação dos critérios clínicos da FH. A amostra de estudo consistiu em 40 casos-índex (crianças e adultos de ambos os sexos) referenciados ao INSA por suspeita clínica de FH. A caracterização bioquímica permitiu avaliar o fenótipo do doente e inferir sobre a aplicação de critérios de diagnóstico clínico de FH. A caracterização molecular incluiu a pesquisa de alterações nos genes LDLR, APOB e PCSK9, recorrendo às metodologias de dHPLC, sequenciação automática e MLPA. Em 5 doentes que apresentavam também TG elevados foi efectuada a pesquisa de alterações nos genes LPL, APOC2, APOC3, APOA4 e APOA5, por sequenciação automática dos mesmos. O estudo molecular dos 40 casos-índex estudados identificou 15 (37,5%) indivíduos com FH. Em 31-39% dos 609 casos-índex portugueses já estudados no EPGH, o diagnóstico clínico resultante da aplicação dos 2 critérios clínicos de FH aplicados não coincide com os resultados do estudo molecular. Relativamente à FCHL, o estudo molecular somente identificou alterações que estão descritas como polimorfismos. A identificação precoce de casos-índex com dislipidemia familiar e dos seus familiares em risco pode aumentar a qualidade e a esperança de vida destes indivíduos, por aplicação de uma orientação terapêutica adequada, que possa possibilitar a redução da incidência de doenças cardiovasculares prematuras.; [eng]Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disorder that is characterized by increased levels of cholesterol and premature arteriosclerosis and cardiovascular disease. Mutations in LDLR, APOB and PCSK9 genes are responsible for FH. Familial combined hyperlipidaemia (FCHL) is a polygenic disorder also related with the presence of premature cardiovascular disease. The phenotype of FCHL has been associated with defects in the LPL, APOC2, APOC3, APOA4 and APOA5 genes. The aim of this work was the clinical and molecular characterization of patients with a clinical diagnosis of familial dyslipidaemia, particularly FH. Another purpose of this study was the evaluation of the clinical criteria for FH. The sample was composed of 40 index patients (adults and children of both sexes), referred to INSA with clinical diagnosis of FH. The biochemical characterization allowed the evaluation of the phenotype of the patient and made possible the inference of the application of clinical diagnostic criteria of FH. The molecular characterization included the search for defects in LDLR, APOB and PCSK9 genes, using the techniques of dHPLC, automated sequencing and MLPA. In 5 of these patients that also presented high levels of TG, the search for defects in LPL, APOC2, APOC3 APOA4 and APOA5 genes was done by automated sequencing. The molecular study of the 40 índex patients had identified 15 (37,5%) patients with an alteration in one of the three genes associated with FH. In 31-39% of the total 609 Portuguese índex patients that had already been studied by PFHS, the clinical diagnosis obtained from the application of the clinical criteria didn´t match with the results from the molecular study. The molecular study of genes associated with FCHL had just identified genetic defects that are referred as polymorphisms. An early identification of index patients with familial dyslipidaemia and of relatives at risk can increase the quality of life and the life expectancy, by the application of an adequate therapy that can help to reduce the incidence of premature cardiovascular diseases. Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012.; Dissertação defendida e aprovada em 21 de Novembro de 2012.; Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP, Grupo de Investigação Cardiovascular (Setembro 2011 – Setembro 2012).; Mafalda Bourbon: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Wed, 21 Nov 2012 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10400.18/1235 2012-11-21T00:00:00Z