http://hdl.handle.net/10400.18/44 2013-05-23T17:02:06Z http://hdl.handle.net/10400.18/1357 Title: Towards the identification of biomarkers for cystic fibrosis by proteomics Authors: Charro, Nuno Miguel Antunes Garcia Abstract: The scope of the work presented in this thesis is to provide identification and characterization of proteins that might contribute to the development and/or progression of the pulmonary disease Cystic Fibrosis (CF), aiming to a better understanding on the proteinaceous environment in several biological samples with influence in the disease. The objectives of this work were in accordance with the actual and to-date Portuguese National Health Plan and were developed in the National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge in Lisbon, Portugal, in collaboration with the University of Pittsburgh Medical Centre and the National Cancer Institute at Frederick, both in the United States of America. The involvement of such institutions recalls the importance of this study in trying to unravel mechanisms underlying the development and/or progression of this treatable but incurable disease. This thesis is divided in six chapters which contain results already published or under final preparation for submission to peer reviewed scientific journals of the area, according to point 1 of Artigo 41 from Capítulo V of Regulamento de Estudos Pós- Graduados da Universidade de Lisboa, published in Diário da República, 2ª Série - Nº 209 de 30 de Outubro de 2006. In this context, I hereby state that all the experiments, results and interpretation contained here are original and performed by myself with the collaboration of others where mentioned. The Chapter I corresponds to the General Introduction, where several aspects of the CF’s pathology are approached, since its recognition as an independent disease to the several CF-causing mutations and the phenotype evidenced by the patients. The contribution of several others molecular determinants other than the CFTR alone and the role of Proteomics in these achievements is also described. xxv iii Experimental design, methodologies, results and interpretation are provided in chapters II to V, each one dedicated to a different type of biological sample. Chapter II devotes it to the proteomics characterization of human serum by complementary approaches and integration of the identified species into networks and pathways with biological significance in the context of CF. Chapter III describes the characterization of the CF-associated proteome of mRBC and aims to interpreter previous phenomena reported in these cells of CF patients by the study of altered abundances levels of some relevant proteins. Chapter IV provides a wide molecular portrait of proteins being expressed in the nasal epithelial cells ultimately demonstrating the usefulness of this easily collectable biological sample in mimicking lungs’ microenvironment and its application to the study of respiratory diseases. Chapter V makes use of the deep proteome profiling of nasal epithelial cells and establish correlations and consequences for the impaired respiratory function observed in CF patients. Finally, a General Discussion is presented in Chapter VI were the main conclusions and remarks are pointed hoping to unveil new perspectives on CF while open novel questions to be answered by Proteomics.; [POR] A Fibrose Quística (FQ) é a doença monogénica autossómica recessiva mais frequente e letal na população caucasiana, com uma incidência de 1 em cada 2500-3200 recém-nascidos sendo que 1 em cada 25-30 indivíduos apresentam pelo menos uma mutação no gene responsável pela patologia. Esta doença é causada por mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) que codifica para uma proteína com o mesmo nome e cuja principal função é servir de canal de cloreto regulado pelo cAMP (do Inglês, cyclic Adenosine Monophosphate) e cujos ciclos de abertura e fecho dependem do ATP (do Inglês, Adenosine Triphosphate) na membrana apical das células epiteliais. Actualmente, conhecem-se mais de 1800 mutações no gene da CFTR mas a delecção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 da cadeia polipéptídica (F508del; F508) constitui cerca de 70% dos cromossomas FQ analisados e está presente em cerca de 90% dos doentes de FQ, originando um produto com problemas ao nível da maturação e, consequentemente, disfuncional. Defeitos na síntese, estrutura, processamento e/ou função da CFTR ditam uma multiplicidade de sintomas observados nestes doentes: elevadas concentrações de cloreto e sódio no suor, insuficiência pancreática, disfunção intestinal e hepática, infertilidade e obstrução das vias respiratórias por um muco espesso e desidratado, criando as condições propícias ao desenvolvimento de infecções respiratórias crónicas e um estado de inflamação constante. De facto, a maior parte dos doentes FQ vê a sua qualidade de vida significativamente diminuída pela deterioração progressiva da função pulmonar que, em última instância, conduz à morte. Vários estudos têm sido efectuados no sentido de estabelecer uma relação entre o genótipo apresentado pelos doentes FQ e as manifestações clínicas da doença, tarefa dificultada pela heterogeneidade de mutações e sintomas apresentados pelos doentes bem como pela influência que o ambiente e outros factores celulares (denominados de genes modificadores da FQ) exercem. Dessa forma, importa conhecer que entidades celulares são estas cuja expressão e função poderão influenciar o desenvolvimento e/ou progressão da FQ, podendo mesmo constituir alvos terapêuticos da doença. Uns dos candidatos óbvios a este lugar são as proteínas. O seu estudo através das várias metodologias disponibilizadas pela Proteómica tem permitido um grande avanço na caracterização e conhecimento dos mecanismos envolvidos no processamento da CFTR; importa agora conhecer e investigar todo o ambiente proteico que contribui para o desenvolvimento e progressão da patologia. xxx O trabalho apresentado nesta tese surge como uma continuação da investigação que tem vindo a ser desenvolvida no Laboratório de Proteómica do Departamento de Genética do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge que se iniciou com o estudo dos mecanismos envolvidos no processamento e maturação da CFTR em linhas celulares, seguindo depois para um modelo animal tentando identificar proteínas diferencialmente expressas em pulmão e sua relevância para o desenvolvimento da doença pulmonar até ao estudo de amostras biológicas humanas no sentido de melhor caracterizar e compreender outras proteínas que não apenas a CFTR cujas alterações nos seus níveis de expressão poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos da patologia. Neste trabalho, foram analisados soro, membranas de eritrócitos e células do epitélio nasal de doentes de FQ em comparação com indivíduos saudáveis portadores ou não de uma mutação no gene CFTR, através de várias metodologias tecnológicas da Proteómica. Os objectivos foram atingidos com recurso a tecnologias existentes no Laboratório de Proteómica em Lisboa, como por exemplo a separação de proteínas por 2-DE (do Inglês, Two-Dimensional Electrophoresis) e sua identificação por MS (do Inglês, Mass Spectrometry), mais propriamente por MALDI-TOF/TOF (do Inglês, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-tandem Time of Flight) em colaboração com outros laboratórios nos EUA (Clinical Proteomics Facility, University of Pittsburgh Medical Centre, Pennsylvania e Laboratory of Proteomics and Analytical Technologies, National Cancer Institute at Frederick, Maryland) que nos permitiram fazer uso de tecnologias de ponta tanto na separação robusta como na identificação confiante de proteínas por MudPIT (do Inglês, Multidimension Protein Identification Technology). No capítulo II, são apresentadas e discutidas as funções de proteínas diferencialmente expressas que poderão ter implicações para a doença no soro dos vários grupos de indivíduos estudados. A razão deste estudo prende-se com o elevado potencial do soro para a identificação de biomarcadores por conter um elevado número de proteínas provenientes de todos os órgãos do organismo, ser de fácil colheita e constituir uma amostra biológica por excelência para a implementação de testes clínicos. A inovação deste estudo centra-se na utilização de técnicas complementares de separação e identificação de proteínas, nomeadamente 2-DE-MALDI-TOF/TOF MS e xxxi MudPIT. Por 2-DE foram identificadas 28 proteínas únicas a partir de 78 spots de gel enquanto por LC-MS/MS o número de proteínas identificadas aumentou para 569. A utilização de diversas ferramentas bioinformáticas permitiu ainda alocar estas proteínas a processos com significância biológica e cuja regulação tem sido amplamente descrita em FQ: remodelação dos tecidos, desequilíbrio na razão proteases/antiproteases, inflamação, estado nutricional e stresse oxidativo ou disfunção imune, entre outros. A estratégia aplicada demonstrou ser eficiente na elucidação de processos e no conhecimento mais alargado de proteínas activamente implicadas na patogénese da FQ que é corroborado por diversos estudos já publicados. Para além de estudar a componente líquida do sangue, pretendeu-se também estudar parte da sua componente sólida, as membranas de eritrócitos, uma vez que estudos têm sugerido o papel destas células no desenvolvimento de hipertensão pulmonar em FQ, embora de uma forma pouco clara. A presença da CFTR nos eritrócitos tem sido demonstrada por alguns autores através da modulação da sua actividade e/ou por métodos imunológicos. Os nossos dados confirmam a presença da CFTR na membrana dos eritrócitos e constituem, portanto, o primeiro estudo que reporta a sua identificação por MS nestas células. Contudo, esta identificação só foi possível em eritrócitos de doentes homozigóticos para a ∆F, provavelmente por haver maior acumulação desta proteína misfolded pelo controlo de qualidade da célula. O estudo da caracterização do proteoma presente nas membranas dos eritrócitos de doentes FQ revelou um número de proteínas diferencialmente expressas associadas a processos que poderão estar na base do desenvolvimento da hipertensão pulmonar nestes doentes: desregulação e desequilíbrio na manutenção da forma e deformabilidade dos eritrócitos, com consequências ao nível da incapacidade de libertação de ATP e produção do vasodilatador pulmonar óxido nítrico (NO), e aumento do seu stresse oxidativo com implicações no aumento da susceptibilidade para a peroxidação lipídica das membranas e redução das defesas contra agressões externas, podendo levar, em última instância, à deterioração da função pulmonar nestes doentes. O conjunto de resultados aqui obtidos permite oferecer um conhecimento mais consubstanciado sobre processos já elucidados mas cujos cujas proteínas associadas estavam ainda caracterizadas. xxx ii Sendo o pulmão o principal órgão afectado na FQ, torna-se claro que a amostra biológica desejável para a condução de estudos para descoberta de biomarcadores será uma biopsia deste tecido. No entanto, e por diversas razões entre as quais se destacam as éticas e as clínicas, o acesso a este tipo de amostras é muito restrito em doentes e/ou mesmo impossível quando se trata de indivíduos controlos. Várias amostras como lavado nasal e brônquico ou expectoração têm sido usadas com este objectivo, não representando contudo as características celulares do tecido uma vez que constituem fluidos segregados. A utilização das células do epitélio nasal obtidas por escovagem da cavidade nasal tem sido considerada um bom modelo biológico por mimetizar as condições das vias respiratórias inferiores e cuja colheita é deveras mais fácil. Dado que o proteoma do epitélio nasal humano estava ainda pouco caracterizado, no Capitulo IV é apresentado um estudo proteómico exaustivo das proteínas que o constituem. Através da aplicação de metodologias de pré-fraccionamento celular para extracção de proteínas solúveis e membranares, combinadas com análise de larga escala através de MudPIT, foram identificadas mais de 7000 proteínas das quais 1482 foram consideradas com confiança como características e representativas do epitélio nasal. Comparações de resultados com diversas bases de dados permitiram a identificação de várias funções associadas à manutenção e função de um epitélio estruturado, na percepção e resposta a agressões externas, assim como uma significativa sobreposição entre proteínas identificadas no epitélio brônquico e neste epitélio nasal e sua correlação com diversas doenças respiratórias, entre as quais cancro do pulmão, síndroma respiratório agudo grave, pneumonite, asma e mesmo FQ. A conjugação das várias observações apoia a hipótese que o epitélio nasal reflecte certos aspectos das vias respiratórias inferiores e contribui significativamente para o incremento de conhecimento do fenótipo do epitélio respiratório, permitindo análises comparativas em condições patológicas como a FQ. A informação resultante da caracterização do proteoma das células do epitélio nasal serviu como base para identificação de proteínas diferencialmente expressas como consequência de FQ, apresentada no Capítulo V. A identificação de processos relacionados com a remodelação dos tecidos, o stresse oxidativo e a inflamação foram identificados neste epitélio como associados a FQ. Também foram evidenciados a disfunção mitocondrial e desregulação nos mecanismos de produção energética, metabolismo da glucose ou degradação da matriz extracelular, entre outros. A identificação de proteínas diferencialmente expressas e que interactuam com a CFTR e a identificação/participação de proteínas conhecidas como modificadoras da FQ revestese também de fulcral importância para patogénese pulmonar da FQ. Em suma, os resultados obtidos nas várias amostras biológicas de doentes FQ estudas, por diferentes abordagens proteómicas, permitiram obter conhecimentos únicos que consideramos de base sólida para uma melhor compreensão da patologia FQ e possibilitar o desenho de estudos posteriores e dedicados a proteínas/funções elucidadas com o objectivo de validação de alguns potenciais biomarcadores de diagnóstico/prognóstico/monitorização e/ou alvos terapêuticos específicos que permitam distinguir a FQ de outras doenças respiratórias. Description: Tese de doutoramento em Biologia Molecular apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2011. Tese defendida e aprovada em 17 janeiro 2012. 2011-09-29T11:20:39Z http://hdl.handle.net/10400.18/1346 Title: Chronic Obstructive Pulmonary Disease: A Proteomics Approach Authors: Alexandre, Bruno Miguel Coelho Abstract: Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by chronic airflow limitation that is not fully reversible even under bronchodilators effect, caused by a mixture of small airway disease 􀍴 obstructive bronchiolitis 􀍴 and parenchymal destruction 􀍴 emphysema. At the present time, COPD is the fourth leading cause of death and its prevalence and mortality are expected to continue increasing in next decade. Spirometry is the most reproducible way to measure lung function and is nowadays the best tool to diagnose airflow limitation and, consequently, diagnose COPD itself. Biomarkers for diagnosis and/or prognosis as well as novel targets for the development of more effective therapies for COPD are still needed. Proteomics has the capacity to provide large-­‐scale information and consequently it has the potential to expand previous knowledge on COPD. Surprisingly, given the need for new biomarkers in COPD and the power of proteomics, proteomics have been quite neglected so far. Up to date only 50 reports (14 are reviews) match the search at Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed, accessed June 23, 2011) for COPD proteomics. Hence, there is a clear need to engage clinically valuable proteomics studies in order to match the need for new biomarkers in COPD. In last decade, the shotgun proteomics approach has become the method of choice for identifying and quantifying proteins in most large-­‐scale studies. Compared with 2DE, shotgun proteomics allows higher data throughput and better protein detection sensitivity. This strategy is based on trypsin digestion of proteins into peptides. This produces a complex peptide mixture that is then separated by one-­‐ or multiple dimensional liquid chromatography (LC) and subjected to peptide sequencing using tandem mass spectrometry (MS/MS) before automated database searching. In the present work we have employed different methodologies within shotgun proteomics to generate solid and comprehensive data in COPD. There are quite a lot biological materials that can be used to investigate biomarkers for this disease. Although COPD is now known to possess a systemic inflammation xii component which is responsible for affecting other organs, it is in the lung that the events that lead to breathless take place. Investigating to the lung directly is therefore an optimal strategy to be able to identify proteins that may not be detectable elsewhere either because they are not present or diluted into undetectable concentrations. But this means that lung tissue has to be collected by biopsy which is an extremely invasive technique. But besides tissue biospecimens, other sources of biological materials used to study COPD is biofluids which includes sputum, bronchoalveolar and nasal lavage fluid, exhaled breath condensate, and blood. It had been observed before by means of microscopy that red blood cells (RBCs) from COPD patients showed deformations in their shape. RBCs are crucial to the uptake of oxygen from the lungs to the cells and this transport is dependent on their ability to change shapes rapidly while navigating through blood vessels. In addition, RBCs play a crucial role in antioxidant defense when fighting against oxidative stress, which has long been recognized as feature of COPD. In this work we made use of a RBC membrane fractionation procedure, stable isotope labeling and bidimensional liquid chromatography (strong cation exchange / reverse phase) before sample acquisition using a high-­‐resolution fourier transform -­‐ ion cyclotron resonance (FT-­‐ICR) mass spectrometer (Chapter III). A total of 4697 peptides were quantified as present in both COPD and control spectra corresponding to 1083 proteins. Three-­‐hundred and fourteen proteins possessing at least two peptides were identified, 46% of which were annotated as membrane proteins. Golgin-­‐245/p230 (GOLGA4), was identified as overexpressed in COPD, a protein which is reported to be essential for intracellular trafficking and cell surface delivery of tumor necrosis factor-­‐􀉲 (TNF), the main proinflammatory cytokine made and secreted by inflammatory macrophages enhancing activation and recruitment of T-­‐cells and ensuring robust innate and acquired immune responses. Chorein or Vacuolar protein sorting-­‐associated protein 13A (VPS13A) is reported to play a role in the cytoskeleton organization has been associated with thorny deformations of circulating erythrocytes, possibly due to red cell membranes deformation. This protein was found to be underexpressed in COPD patients when compared to controls by MS and this underexpression was confirmed by WB. Consequently, underexpression of chorein may play an important role in the deformation of COPD RBCs. Many other interesting proteins were identified in the xiii context of COPD and, additionally, there were a considerable number of proteins described in RBC for the first time (Chapter III). To overcome the difficulty of acquiring fresh biopsies of well characterized patients, we have established in our laboratory a procedure to collect human fresh nasal epithelial cells. We have shown previously that these cells presented similar proteome of epithelial cells presented in the lower airway. Here, two different types of studies were presented using these cells: a study performed on the effects of cigarette smoke, which is the main risk factor for developing COPD (Chapter IV) and a comparative proteomic study between COPD patients and healthy individuals (Chapter V). Both were pioneer studies by investigating the proteome of fresh nasal epithelial cells from cigarette smoker subjects (Chapter IV) or COPD patients (Chapter V). In both studies a high-­‐resolution mass analyzer, the orbitrap, was employed increasing the number of confident peptide/protein identifications. In Chapter IV, ninety-­‐six proteins were found to be differentially expressed between the proteomes of healthy smokers and nonsmokers. These proteins were related to processes of antigen presentation, cell-­‐to-­‐ cell signaling and interaction, cell morphology, drug metabolism, DNA repair, energy production or mitochondrial dysfunction. Although requiring further orthogonal validation, our data was consistent with previous evidences showing CD44, MUC5AC or SOD2 differential modulation in smokers due to inflammatory response pathways. In Chapter V, 89968 peptides and 1475 proteins were identified in total, of which 1173 proteins were identified by at least two peptides. We were able to confirm previous evidences that UPR is activated in COPD patients since we were able to observe overexpression in a considerable number of proteins involved in different protein complexes involved in UPR. This includes overexpression of VCP, both components of the Hsp10/Hsp60 chaperone complex (HSPD1 and HSPE1), CALR and two members of a large ER-­‐localized multiprotein complex of at least 11 proteins, PPIB and ERP29. We also observed an increase in expression of proteins related to Nrf2-­‐mediated oxidative stress response such as GSTP1, TXNRD1 and GSR. Additionally, we also report an increase in drug metabolism, as all significantly differentially expressed proteins related to this biofunction were overexpressed in COPD: GSTP1, GSR, AKR1C3 and ANXA2. Further validation by orthogonal methods is needed so that the activation of xiv UPR and Nrf2-­‐mediated oxidative stress response and the increase in drug metabolism on the nasal epithelial cells of COPD patients is fully confirmed. In Chapter VI, serum collected from COPD patients was divided into 4 different groups in all different combinations of presence/absence of the two main features of COPD, chronic bronchitis and emphysema, to study their impact in the serum proteome. Due to its complex protein mixture, serum was first immunodepleted from its most abundant proteins, comprising about 94% of total protein content, before being analyzed by 1D-­‐PAGE 􀍴 LC-­‐MS/MS (GeLC-­‐MS/MS) in a linear ion trap mass spectrometer. This powerful strategy was able to identify as many as 2856 proteins, of which 929 were identified by two or more peptides. Plasminogen was found to be underexpressed in COPD patients that suffer simultaneously from emphysema and chronic bronchitis, while it maintained about the same expression level over the three other groups of COPD patients and this differential expression was successfully validated by ELISA. It was possible to identify other interesting proteins as TRAF3IP2, which is associated with innate immunity in response to pathogens, inflammatory signals and stress and has also been implicated in airway hyperresponsiveness or Isoform 1 of phosphatidylinositol-­‐glycan-­‐specific phospholipase D (GPLD1), which is GPI degrading enzyme that was described to be responsible for secretion of prostasin, which was the first of several membrane serine peptidases found to activate the epithelium-­‐sodium channel (ENaC). Prostasin was also reported to have a critical role in regulating epithelial sodium transport in normal and pathological conditions in the lung. The work herein presented confirmed a few findings that had already been reported and more important revealed new insights into COPD disease mechanisms as well as provided new candidate biomarkers for these diseases. Further validation and integration of all data obtained into a systems biology approach will certainly contribute to increase knowledge of COPD and ultimately bringing the well being of patients.; [POR] A Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (DPOC) é caracterizada por uma limitação obstrutiva do fluxo aéreo do exterior para os alvéolos e destes para o exterior. Esta limitação ventilatória não é completamente reversível mesmo após a administração de um broncodilatador e tende a ser progressiva. As causas que conduzem a esta limitação são um conjunto de patologias respiratórias do qual fazem parte a bronquite crónica e o enfisema. Para a obstrução do débito de ar na bronquite crónica, contribuem a inflamação das vias aéreas inferiores, a cicatrização das suas paredes, o edema do seu revestimento, o muco e o espasmo do músculo liso. A bronquite crónica manifesta-­‐se por tosse frequente e produção aumentada de expectoração. No entanto nem todos os doentes portadores de bronquite crónica têm ou irão desenvolver uma limitação crónica do fluxo aéreo. No caso do enfisema, as paredes alveolares estão destruidas, pelo que os bronquíolos perdem o seu apoio estrutural e, por isso, entram em colapso quando expiram o ar. Por conseguinte, no enfisema a redução do fluxo de ar é permanente e de origem estrutural. Actualmente, nenhum tratamento tem a capacidade de reduzir a progressão da DPOC ou suprimir a inflamação das vias aéreas de pequeno calibre e do parênquima pulmonar. Nos dias de hoje, a DPOC é a quarta causa de morte no mundo e prevê-­‐se que a sua prevalência e mortalidade continuem a aumentar ao longo da próxima década. Em Portugal e de acordo com um relatório divulgado pelo Observatório Nacional das Doenças Respiratórias (ONDR), cerca de 540 000 pessoas sofriam de DPOC em 2007, o que significa que 5,2% da população padece desta condição. Recentemente, um relatório divulgado pela iniciativa Burden of Obstructive Lung Disease (BOLD), revelou que a taxa de prevalência de DPOC em Portugal é de 14,2%. A espirometria é fundamental no diagnóstico e na avaliação da DPOC por ser o meio mais objectivo, padronizado e facilmente reprodutivel de medir o grau de obstrução das vias aéreas. Considera-­‐se que existe obstrução brônquica e, portanto, DPOC, quando após a administração de um broncodilatador a relação FEV1/FVC é menor do que 70% (FEV1 􀍴 Volume Expiratório Máximo no 1.º segundo; FVC 􀍴 Capacidade Vital Forçada) A Proteómica tem a capacidade de provedenciar informação em larga escala e, consequentemente, de alargar o actual conhecimento da DPOC. Surpreendentemente dada a necessidade de encontrar novos biomarcadores em DPOC e do potencial da proteómica, esta tem sido negligenciada na investigação da doença até aos dias de hoje. Actualmente, existem apenas 50 publicações científicas, dos quais 14 são artigos de revisão, correspondentes a uma pesquisa no site da PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed, acedido em 23 de Junho de 2011).Portanto, existe uma clara necessidade de produzir novos estudos de proteómica para colmatar esta lacuna e encontrar novos biomarcadores para a DPOC. Na última década, a abordagem designada por shotgun proteomics tornou-­‐se a abordagem de eleição para a identificação e a quantificação de proteínas em estudos de larga escala. Comparando com a electroforese bidimensional (2DE), esta abordagem permite obter um maior número de identificações de péptidos e proteínas por ter uma maior sensibilidade. A estratégia de shotgun proteomics tem como base a digestão tríptica de proteínas para péptidos que vai conduzir a uma mistura complexa de péptidos que são separados através de uma ou múltiplas dimensões cromatográficas. Posteriormente sofrem uma sequenciação peptídica através de um espectómetro de massa e pesquisa automática contra uma base de dados. No presente trabalho utilizaram-­‐se diferentes metodologias dentro da abordagem shotgun proteomics com o objectivo de gerar resultados contundentes em DPOC. Existe uma vasta gama de materiais biológicos que podem ser usados para procurar biomarcadores para esta doença. Embora a DPOC possua um componente de inflamação sistémica que é responsável por afectar outros orgãos, é no pulmão que os mecanismos que originam a falta de ar estão presentes. Assim sendo, investigar directamente o pulmão é a estratégia ideal para poder encontrar as proteínas responsáveis por esses mecanismos que noutros materiais biológicos podem não estar presentes ou, quando presentes, se encontram em concentrações diminutas conduzindo à sua não detecção. Isto significa ter acesso a tecido pulmonar que é obtido através de biopsia, uma técnica extremamente invasiva. Para além de tecido pulmonar, existem outras fontes de material biológico têm sido utilizadas para o estudo da DPOC como são os casos de expectoração, lavado nasal e lavado broncoalveolar, condensado do ar expirado e sangue e seus componentes. No presente trabalho foram utilizados eritrócitos, células do epitélio nasal e soro para o estudo da doença. Foi reportado por meios de microscopia que os eritrócitos de doentes com DPOC exibiam alterações na sua morfologia. Os eritrócitos são fundamentais no transporte de oxigénio dos pulmões para as células e este transporte depende da sua capacidade para mudar rapidamente a sua forma ao navegar pelos capilares sanguíneos. Os eritrócitos desempenham um papel fundamental no combate ao stress oxidativo, que é uma característica da DPOC. Devido à sua hipotética importância para a doença, eritrócitos foram isolados a partir de sangue total de doentes com DPOC e indivíduos saudáveis. Neste trabalho (Chapter III), foi utilizada uma técnica de fraccionamento membranar em conjunto com uma marcação isotópica com 18O/16O e posterior separação através de cromatografia bidimensional (cromatografia de troca catiónica e de fase inversa). A cromatografia de fase inversa estava directamente acoplada a um espectómetro de massa de alta resolução (espectómetro de massa de ressonância de ião-­‐ciclotrão com transformada de Fourier 􀍴 FT-­‐ICR). Foi possível quantificar um total de 4697 péptidos presentes em ambos os grupos estudados, que corresponderam a 1083 proteínas. 314 proteínas foram identificadas por dois ou mais péptidos, 46% das quais se encontram anotadas como proteínas de membrana. A proteína GOLGA4 foi identificada como estando sobreexpressa em DPOC. Esta proteína está descrita como sendo essencial para o tráfego intracelular e pela colocação à superfície da célula da proteína tumor necrosis factor-­‐􀉲 (TNF), a principal citocina pró-­‐inflamatória produzida e secretada por macrófagos para activação e recrutamento de células T. Foi possível também identificar a proteína VPS13A que está associada a deformações em eritrócitos circulantes, possivelmente devido a deformações na membrana. Como resultado do estudo concluiu-­‐se que em doentes com DPOC esta proteína se encontra subexpressa, resultado que foi confirmado por Western Blot. Devido à dificuldade em adquirir amostras de biópsias pulmonares em doentes com DPOC, foi desenvolvido no nosso laboratório um procedimento para obter células do epitélio nasal. Em trabalhos anteriores foi demonstrado que estas células apresentam um comportamento semelhante às células epiteliais das vias respiratórias inferiores. Dois diferentes tipos de estudo foram realizados com estas células: um estudo sobre os efeitos do fumo do tabaco, que é o principal factor de risco para o desenvolvimento de DPOC (Chapter IV) e um estudo comparativo entre doentes com DPOC e indivíduos saudáveis (Chapter V). Ambos os estudos são estudos pioneiros uma vez que o proteoma de células do epitélio nasal nunca tinha sido descrito quer em indivíduos saudáveis fumadores, quer em doentes com DPOC. No primeiro estudo, 96 proteínas foram identificadas como diferencialmente expressas entre fumadores e não fumadores saudáveis. Estas proteínas estão relacionadas com processos de apresentação de antigénios, sinalização e interacção celular, morfologia celular, metabolismo de xenobióticos, reparação de DNA, produção de energia e disfunção mitocondrial. Os resultados obtidos foram consistentes com anteriores evidências que mostram uma diferente modulação de CD44, MUC5AC ou SOD2 em fumadores devido a processos de resposta inflamatória. No segundo estudo, foram identificados um total de 89968 péptidos correspondentes a 1475 proteínas das quais 1173 foram identificadas por dois ou mais péptidos. Foi possível confirmar resultados obtidos em estudos anteriores que referiam que mecanismos de Unfolded Protein Response (UPR) se encontravam activados em doentes com DPOC, uma vez que foi observada a sobreexpressão de um númeo considerável de proteínas envolvidas em diferentes complexos de proteínas relacionados com UPR. Exemplos dessas proteínas incluem a VCP, os dois componentes do complexo Hsp10/Hsp60, a CALR e dois membros de um grande complexo composto por, pelo menos, 11 proteínas, localizado no retículo endoplasmático: PPIB e ERP29. Foi também possível observar um aumento na expressão de proteínas relacionadas com os mecanismos de resposta ao stress oxidativo mediados por Nrf2, como GSTP1, TXNRD1 e GSR. Relativamente ao estudo efectuado com o soro (Chapter VI), quatro grupos foram constituídos para estudar as diferentes combinações de presença/ausência dos dois principais componentes da doença: a bronquite crónica e o enfisema. Uma vez que o soro é uma mistura complexa de proteínas, o soro de doentes de DPOC foi primeiramente imunodepletado das suas proteínas mais abundantes, que representam cerca de 94% do seu conteúdo total de proteína. As amostras de soro imunodepletado foram analisadas através de 1D-­‐PAGE 􀍴 LC-­‐MS/MS (GeLC-­‐MS/MS). Esta poderosa estratégia permitiu a identificação de 33049 péptidos correspondentes a 2856 proteínas, das quais 929 foram identificadas por dois ou mais péptidos. Foi possível observar uma subexpressão de PLG em doentes com DPOC que sofrem simultaneamente de enfisema e bronquite crónica. Esta subexpressão foi validada através de ELISA. Outras proteínas de interesse foram encontradas diferencialmente expressas em cada um dos grupos de doentes com DPOC, entre as quais TRAF3IP2, que está associada à resposta imunitária inata a patogéneos e à resposta exacerbada das vias respiratórias. O trabalho aqui descrito confirmou evidências anteriormente reportadas e ao mesmo tempo formulou novas hipóteses para os mecanismos da doença e revelou potenciais novos biomarcadores. Embora alguns resultados necessitem de posterior validação através de técnicas ortogonais, o presente trabalho tornou possível a descoberta de proteínas e, inclusivamente, vias metabólicas que não tinham sido anteriormente associadas à DPOC. Este trabalho enfatiza também o uso de células epiteliais nasais na investigação da patogénese da doença, uma vez que pode conduzir/conduz à identificação de novos biomarcadores específicos desta doença. Description: Tese de Doutoramento em Biologia Molecular apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012; Deborah Penque: Departamento de Genética Humana do INSA, IP. 2012-01-17T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.18/1133 Title: The role of Rac1-modulated gene transcription in tumorigenesis Authors: Barros, Patrícia Abstract: Gene expression regulation is a dynamic and multi-step process, in which transcription plays a major role. Transcription initiation depends on binding of transcription regulators to DNA elements located in promoter or enhancer regions, a process often controlled by signalling pathways. One such pathway is regulated by Rac1, a member of the Rho family of small GTPases involved in cell proliferation, adhesion and migration. In this work, novel links between Rac1 signalling and transcriptional regulation in colorectal tumour cells are described. First, it is shown that Rac1 activation leads to PAK1-mediated phosphorylation of the transcriptional repressor BCL-6 in colorectal cancer cells, inactivating its repressor function. In the presence of active Rac1, BCL-6 redistribution within the nucleus, a reduction in its affinity to chromatin and increased expression of the endogenous target genes NFKB1 and CD44, and of a BCL-6-controlled luciferase reporter construct were observed. Next, it was found that Rac1 signalling promotes gene transcription by inducing a transcriptional switch from the repressor BCL-6 to the activator STAT5A at the promoter of certain target genes. Using chromatin immunoprecipitation, it is demonstrated in different colorectal cell lines that active Rac1 promotes release of BCL-6 with concomitant nuclear translocation and binding of STAT5A at the same promoter site. Three endogenous cell-cycle-related genes (CCND2, CDKN2B, SUMO1) were identified to be inversely regulated by BCL-6 and STAT5A and shown to respond to Rac1 signalling with promoter occupancy switches that correlate directly with changes in their expression levels. This work provides new mechanistic insights into how Rac1 signalling modulates gene transcription through the switching between transcription factors and contributes to uncovering the implications of deregulated Rac1 activity in cancer. Description: Tese de Doutoramento em Biologia (Biologia Molecular) apresentada ao Instituto de Tecnologia Química e Biológica da Universidade Nova de Lisboa, 2012. 2012-11-29T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10400.18/974 Title: Diagnóstico Genético Pré-implantação: a prática, a técnica e a ética Authors: Oliva Teles, Natália Abstract: Com o avanço das técnicas de Procriação Medicamente Assistida (PMA), surgiu em 1990 a primeira criança nascida após diagnóstico genético pré-implantação (DGPI). Neste tipo de análise, posteriormente ao estudo feito em geral entre o terceiro e o quinto dias pós-fertilização, só os embriões não afetados são transferidos para o útero materno. O DGPI, apesar de necessitar de técnicas relativamente recentes e dispendiosas, oferece boas perspetivas a casais em risco para determinadas doenças genéticas graves, em alternativa ao diagnóstico pré-natal convencional, particularmente nos casos em que seja necessário realizar PMA – nestes, é mais defensável a seleção embrionária precoce do que a necessidade de realizar uma interrupção de gravidez tardia. Os problemas éticos que se colocam no DGPI começam antes da execução do diagnóstico, com o aconselhamento genético não-diretivo, a obtenção do consentimento informado e a estrita manutenção da confidencialidade; os maiores problemas dizem respeito ao estatuto do embrião humano, à investigação e manipulação de embriões, à seleção de sexo e eugénica e à afetação de recursos. Em Portugal, com a Lei n.º 32/2006, relativa à Procriação Medicamente Assistida, posteriormente regulamentada por documento próprio em 2008, todo o procedimento médico e laboratorial ficou mais clarificado tendo o ordenamento jurídico citado contemplado temáticas fulcrais, como o destino a dar aos embriões excedentários ou em que condições poderá ser permitida a investigação embrionária. Todavia, como demonstrado no inquérito comparativo efetuado, utilizando questionários recolhidos em 2001 e 2010, os maiores problemas éticos que se colocam aos profissionais da área da medicina da reprodução são os relacionados com o início da vida humana. Partindo destes pressupostos e antevendo algumas dificuldades nas tomadas de posição para resolução de conflitos de natureza ética, o grande desafio das próximas gerações será a definição de limites considerados razoáveis para a “correção embrionária” de sociedades futuras, nunca esquecendo a aplicação dos quatro princípios bioéticos fundamentais – autonomia, beneficência, não-maleficência e justiça.; ABSTRACT Following the advances in the techniques of Medically Assisted Reproduction (MAR), 1990 saw the first child born after the development of preimplantation genetic diagnosis. In this analysis embryos are tested for the presence of genetic anomalies at three to five days after fertilization and only unaffected embryos are transferred to the maternal uterus. The technique offers good prospects to couples at risk for conventional prenatal diagnosis. It is particularly useful where MAR techniques are necessary, in which early embryo selection avoids later termination of pregnancy. Ethical problems related to this technique start well before the analysis with the need for detailed non-directive genetic counselling, obtaining fully informed consent for the procedure and maintaining strict confidentiality; the main ethical problems are concerned with the status, investigation and manipulating of the embryo, eugenic or sex selection and the provision of resources. In Portugal the application of laws concerning regulation of Medically Assisted Reproduction in 2008 has clarified and formalised the medical and laboratory procedures and in some cases fundamentally changed them, particularly in the requirement to cryopreserve all high quality non-transferred embryos and in specifying conditions in which embryo experimentation may be permitted. Overall, as is shown by comparison of questionnaires from 2001 and 2010, the major ethical problems that confront professionals in this area of medicine are related to the beginning of life. Based on the motives discussed in the thesis and foreseeing some of the difficulties in taking positions for the resolution of such problematic conflicts of ethical attitudes, the great challenge in ethics in the next few generations will be to define the limits of ―embryo correction‖ that are considered reasonable and acceptable for the society of the future while never forgetting to apply the four fundamental ethical principles, autonomy, beneficence, non-maleficence and justice. 2012-01-30T00:00:00Z