http://hdl.handle.net/10400.18/45 2013-05-17T08:57:27Z 2013-05-17T08:57:27Z Vicente, Ana Margarida Moreira http://hdl.handle.net/10400.18/1536 2013-03-22T18:13:34Z 2012-01-01T00:00:00Z

Title: Efeitos adversos de contaminantes estuarinos em células humanas: avaliação da genotoxicidade e desregulação endócrina Authors: Vicente, Ana Margarida Moreira Abstract: [POR]O Estuário do Sado é um ecossistema de elevado valor ecológico e económico, devido às várias atividades de pesca que suporta. Contudo, esses valores estão ameaçados pela contaminação dos sedimentos e da água do estuário por compostos com um reconhecido potencial mutagénico e carcinogénico. Este trabalho pretendeu contribuir para a avaliação do risco para a saúde humana decorrente da contaminação do Estuário do Sado, através da caracterização do potencial citotóxico e genotóxico de extratos fracionados obtidos a partir de amostras de sedimentos. Para além disso, pretendeu-se implementar um ensaio de avaliação das propriedades de desregulação endócrina das mesmas amostras. Os sedimentos recolhidos em três locais de pesca do Estuário do Sado (A, C e P) foram fracionados com solventes de diferentes polaridades: n-hexano (fração 2), diclorometano (fração 3) e metanol (fração 4). Tentou implementar-se o ensaio E-screen em células MCF-7, utilizando-se o 17-β-estradiol e o Bisfenol A, como controlo positivo. A caracterização da citotoxicidade e da genotoxicidade foi realizada em células HepG2, recorrendo-se, respetivamente, ao ensaio do vermelho neutro e ao ensaio cometa. As células MCF-7 foram expostas durante um período de 5 dias a várias concentrações dos controlos positivos, de modo, a se medir a proliferação celular. Não se conseguiu no entanto obter nos diferentes ensaios realizados uma reprodutibilidade do método. No ensaio do vermelho neutro foi observada uma diminuição da viabilidade celular principalmente nas frações A4, P3 e P4 o que sugere a existência de contaminantes nestas frações com capacidade de induzir citotoxicidade. No que diz respeito aos efeitos ao nível do ADN, observou-se uma elevação significativa do nível de lesões no ADN apenas nas frações 2 e 4 da amostra P. As diferenças registadas nos efeitos citotóxicos e genotóxicos entre as frações e as várias amostras sugerem que existem diferentes contaminantes nestas amostras, e além disso que diferentes contaminantes são extraídos com cada um dos compostos usados na preparação das diferentes frações. Estes resultados refletem as diferentes pressões exercidas ao longo do Estuário do Sado, e salientam a importância de estabelecer associações entre a identificação e quantificação dos contaminantes presentes nas amostras com os seus efeitos biológicos de modo a tentar tirar ilações sobre um potencial impacto na saúde humana.; [ENG] The Sado Estuary is an ecosystem of high ecological and economic value, due to the fishing activities performed by the local population. Nevertheless, these values are threatened by the contamination of the estuary’s sediments and waters, by compounds with a recognized mutagenic and carcinogenic potential. This study aims to contribute to the evaluation of the potential risk to the human health, associated with the Sado Estuary’s contamination, through the characterization of the cytotoxic and genotoxic potential of fractionated extracts obtained from sediment samples. Furthermore, it was intended to implement an assay to evaluate the endocrine disrupting properties of the same samples. The collected samples from 3 fishing sites of the Sado Estuary (A, C and P) were fractionated with solvents of different polarities: n-hexane (fraction 2), dichloromethane (fraction 3) and methanol (fraction 4). The implementation of the E-screen assay in MCF-7, using 17-β-estradiol and Bisphenol A, as positive controls was attempted. The characterization of cytotoxicity and genotoxicity was performed in HepG2 cells by the Neutral Red and Comet assays, respectively. MCF-7 cells were exposed for 5 days to differences concentrations of the positive controls, in order to measure cellular proliferation. The method reproducibility was not achieved in the different assays performed. In the Neutral Red assay, a decrease in cell viability was observed, mainly for fractions A4, P3 and P4, which suggests the existence of contaminants in these fractions, with the ability to induce cytotoxicity. Regarding the effects at the DNA level, a significant increase in the level of DNA damage was observed for fractions 2 and 4 of sample P. The observed difference in cytotoxic and genotoxic effects, between fractions and samples, suggests the existence of different contaminants in these samples, and, furthermore, that different contaminants are extracted with each solvent used in the extraction process. These results reflect the different anthropogenic pressures along the Sado Estuary’s margins, and emphasize the importance of establishing associations between the identification and quantification of contaminants in sediments and their biological effects, in order to assess the potential impact of the human health. Description: Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012.; Maria João Silva: Departamento de Genética do INSA, IP

2012-01-01T00:00:00Z Simão, Laurentino http://hdl.handle.net/10400.18/1414 2013-02-19T15:32:46Z 2012-03-01T00:00:00Z

Title: Relatorio de Actividade Profissional Authors: Simão, Laurentino Abstract: No presente relatório descrevem-se as atividades realizadas ao longo de 20 anos como técnico especialista em genética e, designadamente, em diagnóstico pré-natal (DPN) de anomalias cromossómicas (capítulo I). O DPN compreende o conjunto de procedimentos que são realizados para determinar se um embrião ou feto é portador ou não de uma anomalia congénita. A sua utilidade estende-se à possibilidade de intervir no diagnóstico, prognóstico e prevenção da doença genética. As doenças cromossómicas têm uma prevalência de aproximadamente 0,7% na população, uma elevada mortalidade e morbidez. As estratégias seguidas no DPN têm mudado ao longo dos últimos 20 anos, passando-se progressivamente da utilização exclusiva de métodos de citogenética clássica (cariotipo) à utilização de métodos de biologia molecular. As gravidezes patológicas merecem uma grande atenção pois a sua caracterização permite, muitas vezes, a identificação de anomalias cromossómicas associadas e estabelecer relações genotipo-fenotipo. Para além da investigação da causa e prognóstico de gravidezes patológicas, que se ilustram com a apresentação de casos de estudo (capítulo II), a realização de análises prospectivas e retrospectivas de séries de casos, ou seja, uma abordagem de cariz epidemiológico permite contribuir para o conhecimento da etiologia de determinados grupos de anomalias no feto e avaliar o valor de novas técnicas ou inovações ao nível laboratorial. Serão apresentados alguns dos trabalhos de carácter científico desenvolvidos pelo candidato na sua atividade profissional e apresentados em reuniões científicas da especialidade, agrupados segundo diversas áreas temáticas, e que mostram a importância atual da análise citogenética A Síndrome de Down (SD) é a anomalia cromossómica mais frequente e a causa isolada mais comum de atraso mental moderado. É a anomalia mais frequente em DPN e constituiu uma das razões para a sua implementação. Será abordada a realização pelo candidato de um estudo sobre o DPN e a SD. Description: Relatório para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina apresentado ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade Ciencias e Tecnologia, Universidade de Nova de Lisboa, 2012

2012-03-01T00:00:00Z Onofre, Claudia http://hdl.handle.net/10400.18/1347 2013-02-14T12:44:46Z 2012-12-14T00:00:00Z

Title: Regulation of gene expression of human hemojuvelin by two small open reading frames and its relevance in the iron homeostasis Authors: Onofre, Claudia Abstract: Iron is an essential element for many biological reactions carried out by living systems. A tight regulation of the systemic iron homeostasis is crucial to avoid pathological conditions of iron deficiency or overload. Juvenile hemochromatosis, is an early-onset inherited disorder associated to an iron overload caused by mutations on the hepcidin gene or in the gene encoding hemojuvelin (HJV). HJV is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-linked membrane protein shown to be a co-receptor for a class of ligands called bone morphogenetic proteins (BMPs), which trigger a response to the iron increase by activating the hepcidin transcription. Thus, HJV is involved on iron homeostasis through regulation of hepcidin transcription levels. A better knowledge of the mechanisms implicated in HJV gene expression is crucial to understand its role in the iron homeostasis. The 5’ leader sequence of the human HJV mRNA has two upstream AUGs (uAUGs) that share the same codon stop, forming two upstream open reading frames (uORFs) with 28 and 19 codons. To evaluate the effect of these uORFs in the translational regulation of HJV, reporter constructs containing several HJV 5’ leader sequences fused to the firefly Luciferase cistron, were tested in HeLa and HepG2 cells. Luciferase activity was measured by luminometry assays and normalized to the corresponding mRNA levels, quantified by real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR), to obtain translation efficiencies. The results revealed that the HJV uORFs decrease the translational efficiency of the main ORF in about 6-fold. Furthermore, we have observed that the HJV mRNA has a low leaky scanning ability that contributes to the translational repression of the main ORF. Thus, translation reinitiation is the main mechanism involved in the production of HJV protein. Aiming to further characterize the mechanism through which the HJV uORFs affect downstream translation, we have observed that the uORF2 encoded peptide seems to cause ribosomal stalling, which also prevents translation of the downstream main ORF. Together, these results produce a framework for understanding how human HJV gene expression is fine-tuned controlled during translation.; [POR] O ferro é um elemento essencial para muitas reacções biológicas envolvidas no funcionamento dos organismos. A regulação rigorosa da homeostase do ferro é crucial para evitar patologias relacionadas com a deficiência ou excesso de ferro no organismo. Nos casos em que a homeostase do ferro é perturbada podem ocorrer diversas patologias tais como a Hemocromatose Juvenil. Esta doença está associada ao excesso de ferro e é devida a mutações nos genes da hepcidina ou da hemojuvelina (HJV). A HJV é uma proteína de membrana com um domínio glicosilfosfatidilinositol (GPI) que tem sido caracterizada como um co-receptor de uma classe de ligandos denominados Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) que desencadeiam uma resposta ao aumento dos níveis de ferro por activação da transcrição da hepcidina. Desta forma, a HJV é responsável pela regulação do metabolismo do ferro através da modelação da transcrição do gene da hepcidina. Um maior conhecimento dos mecanismos implicados na regulação da expressão da HJV seria fulcral para um melhor entendimento da importância desta na homeostase do ferro. A sequencia 5’ líder do mRNA da HJV humana possui dois AUGs a montante do AUG principal (uAUGs) que partilham o mesmo codão de terminação formando duas grelhas de leitura a montante da grelha de leitura principal (uORFs) com 28 e 19 codões. De modo a avaliar o efeito destas uORFs na regulação da tradução da HJV foram testadas várias construções repórter, em células HeLa e HepG2, contendo a sequência 5’ líder do mRNA da HJV humana ligada ao cistrão da Luciferase do pirilampo. A actividade da Luciferase foi medida por luminometria e os correspondentes níveis de mRNA quantificados por reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Os resultados mostram que as uORFs presentes no transcrito da HJV diminuem a eficiência de tradução da ORF principal em cerca de 6 vezes. Além disso, foi verificado que os uAUGs sofrem pouco leaky scanning o que contribui para a repressão da tradução da ORF principal. Assim, a reiniciação da tradução é o principal mecanismo envolvido na produção da proteína da HJV. Visando uma melhor caracterização do mecanismo através do qual as uORFs da HJV afectam a tradução a jusante, verificou-se que a sequência peptídica codificada pela uORF2 parece ter a capacidade de bloquear o ribossoma o que impede a tradução da ORF principal. Juntos, estes resultados contribuem para a compreensão de como a expressão do gene HJV é controlada durante o processo de tradução. Palavras-chave: hemojuvelina (HJV), homeostase do ferro, grelhas de leitura a montante da grelha de leitura principal (uORFs), leaky scanning, reiniciação da tradução e bloqueio do ribossoma. Description: Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012; Luísa Romão: Departamento de Genética Humana do INSA, IP.

2012-12-14T00:00:00Z Pinto da Costa, Eurico http://hdl.handle.net/10400.18/1223 2013-02-11T12:28:37Z 2012-01-01T00:00:00Z

Title: Further contributions towards the molecular analysis of NIPBL and SMC1A genes in a cohort of patients with Cornelia de Lange Syndrome Authors: Pinto da Costa, Eurico Abstract: A Síndrome Cornélia de Lange [CdLS (MIM#122470)] é uma doença multissistémica rara, caracterizada por um fenótipo típico que inclui um dismorfismo facial característico, hirsutismo, atraso no crescimento e desenvolvimento psicomotor, defeitos nos membros, problemas associados a múltiplos sistemas de órgãos, sendo os mais frequentes problemas cardíacos, e refluxo gastrointestinal. A CdLS está associada a defeitos nos genes NIPBL e SMC1A genes (identificados em ~50% e 5% dos doentes, respectivamente), mas outras mutações mais raras foram descritos em outros genes (SMC3, HDCA8, RAD21). A heterogeneidade genética nesta síndrome é explicada ao nível celular, pela proximidade funcional das proteínas codificadas por estes genes, estando envolvidas no complexo das coesinas que unem os cromatídeos irmãos. Em 2005, iniciou-se em Portugal a caracterização clínica e molecular dos doentes com CdLS. A parte inicial deste projecto permitiu a descrição detalhada de treze doentes com novas mutações no gene NIPBL e o desenvolvimento de uma base de dados de mutações específica para este locus (Oliveira et al., 2010). Com a realização desta dissertação de mestrado pretende-se contribuir na caracterização molecular dos restantes 40 doentes Portugueses do grupo de estudo. Os casos não esclarecidos molecularmente foram analisados por outras técnicas nomeadamente, multiplex ligation-dependent probe amplification technique aplicada ao gene NIPBL, e por high resolution melting curve analysis (hrMCA) desenvolvida para o gene SMC1A. A análise do gene NIPBL permitiu a identificação de oito mutações anteriormente descritas na literatura (incluindo um caso com suspeita de mosaicismo somático), três novas mutações (c.86del, c.6983C>G e c.7307C>T), bem como duas grandes delecções neste gene. O desenvolvimento da técnica hrMCA aplicada ao gene SMC1A demonstrou ser eficaz, tratando-se de um método rápido e rentável, tendo permitido a identificação de uma mutação (c.1487G>A). Considerando todos os dados obtidos, foram identificadas mutações em 51% dos doentes Portugueses com CdLS. A utilização de diferentes técnicas moleculares foi essencial para atingir uma taxa de detecção de mutações mais elevada. Devido à recente descoberta de dois genes envolvidos na doença, (HDCA8, RAD21), e existindo ainda uma percentagem razoável de casos sem mutação identificada, é possível que novas causas genéticas de CdLS sejam identificadas neste doentes.; Cornelia de Lange Syndrome [CdLS (MIM#122470)] is a rare multisystemic disorder, characterized by a typical phenotype that includes distinctive facial dysmorphism, hirsutism, growth and psychomotor developmental delay, limb defects, multiple organ system problems such as frequent gastrointestinal and congenital heart defects. CdLS is essentially caused by defects in NIPBL and SMC1A genes (~50% and 5% of cases, respectively), but less frequently mutations have been also described in other genes (SMC3, HDCA8, RAD21). This genetic heterogeneity in CdLS is partially explained by a close functional relationship at the cellular level, since all these genes encode for proteins involved in the sister chromatid cohesion complex. The molecular and clinical characterization of CdLS patients was initiated at the national level in 2005. This initial part of the work enabled the detailed characterization of thirteen CdLS patients with novel NIPBL mutations, and the development of a locus specific database for this gene (Oliveira et al., 2010). The present work intended to unfold new molecular findings in the remaining 40 CdLS patients of our cohort. Molecularly unresolved patients were also analyzed by other techniques such as multiplex ligation-dependent probe amplification technique for NIPBL gene, and by high resolution melting curve analysis (hrMCA) for SMC1A. The analysis of NIPBL gene identified eight mutations previously reported in the literature (including a case with suspected somatic mosaicism), three novel mutations (c.86del, c.6983C>G and c.7307C>T) and two large deletions. The development of hrMCA applied to SMC1A is a fast and cost-effective scanning method, and allowed the identification of one mutation (c.1487G>A). Overall, mutations in SMC1A and NIPBL have been identified in 51% of the Portuguese CdLS patients studied by our group. The combination of different experimental procedure was essential for attaining an enhanced mutation detection rate in CdLS. Considering the distinct gene mutation detection rates a flowchart is proposed for the genetic molecular diagnostic of CdLS. Due to recent discovery of new genes involved in the disease, and considering that several patients are still molecularly uncharacterized, its plausible that in a near future new genetics causes for CdLS will be identified. Description: Dissertação de Mestrado em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2012; Jorge Oliveira, Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (Porto)

2012-01-01T00:00:00Z